色谱技术在中药化学中的应用
1.色谱的基本原理:色谱过程是基于两种互不相溶的“相”溶剂之间分配系数的差异(分配色谱)，组分对吸附剂吸附能力的不同(吸附色谱)，以及分子的交换和分子的大小(排阻色谱)。通常，一般的流动相称为气相色谱，流动相称为液相色谱。
一、吸附色谱法(吸附色谱法)
(1)吸附剂、溶剂与被分离物质性质的关系:液固吸附色谱法是一种应用广泛的方法，特别适用于许多中等分子量样品(分子量小于1，000的低挥发性样品)的分离，尤其是脂溶性组分I一般不适合蛋白质、多糖或离子型亲水化合物等高分子量样品的分离。吸附色谱的分离效果取决于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质。
1.吸附剂:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。
(1)硅胶:色谱用硅胶是一种多孔物质，分子中有硅氧烷交联结构，同时，在颗粒中。
颗粒表面有许多硅烷醇基团。硅胶的吸附与硅醇基团的含量有关。硅醇基团可以通过形成氢键来吸附水，所以硅胶的吸附力随着吸附水的增加而降低。如果吸水率超过17%，吸附力太弱，不能用作吸附剂，但可以用作分配色谱的支撑剂。对于硅胶的活化，当硅胶加热到100 ~ 110℃时，可以除去硅胶表面氢键吸附的水。当温度升至500℃时，硅胶表面的硅醇基也可脱水转化为硅氧烷键，从而因氢键而失去吸水的活性，不再具有吸附剂的性质，即使经过水处理，其吸附活性也无法恢复。所以硅胶的活化不宜在较高的温度下进行(一般在170cC以上有少量结合水流失)。
硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性组分的层析。同时，硅胶是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面的硅醇基团可以释放弱酸性氢离子。当遇到强碱注入物质时，由于离子交换反应，可以吸附碱性化合物。
(2)氧化铝:氧化铝可能是碱性的(因为可以和碳酸钠等成分混合)，对于分离一些碱性的中草药成分，比如生物碱，是比较理想的。但是，碱性氧化铝不适合分离醛、酮、醋、内酯和其他类型的化合物。因为有时碱性氧化铝可以与上述成分发生二次反应，如异构化、氧化、消除等。氧化铝中的碱性杂质可以用水洗至中性而除去，称为中性氧化铝。中性氧化铝还是属于碱性吸附剂的范畴，应该适合酸性组分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，既能中和氧化铝中所含的碱性杂质，又能使氧化铝颗粒表面带有NO3-1或CI-1阴离子，因而具有与交换剂分离的性质，适用于酸性组分的色谱分离。这种氧化铝被称为酸性氧化铝。色谱用氧化铝，用于柱色谱，粒度100 ~ 160目。粒度为100目，分离效果差:小于160目，浓缩流速大且慢，易散带。样品与氧化铝之比一般在1: 20 ~ 50之间，色谱柱内径与柱长之比在1: 10-20之间。
用溶剂洗柱时，流速不能太快。通常，洗脱液的流速应等于每半小时流出的液体毫升数至1小时和所用吸附剂的重量(克)。
(3)活性炭:它是一种非极性吸附剂，应用广泛。一般需要先用稀盐酸洗，再用乙醇洗，再用水洗，然后80℃烘干，进行色谱分析。用于色谱的活性炭应该填充有颗粒。如果是活性炭的细粉，要加入适量的硅藻土作为助滤剂，装在柱内，避免流速过慢。活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类和一些糖苷。活性炭具有良好的吸附效果，但在水溶液和有机溶剂中吸附效果较弱。因此，水的洗脱能力最弱，而有机溶剂的洗脱能力较强。例如，当用乙醇-水洗脱时，洗脱力随着乙醇浓度的增加而增加。活性炭对芳香族化合物的吸附大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附大于对小分子化合物的吸附。利用这些吸附差异，可以将水溶性芳香族物质从脂肪族物质中分离出来，将单糖从多糖中分离出来，将氨基酸从多肽中分离出来。
2.溶剂:色谱过程中溶剂的选择对组分的分离有很大影响。柱色谱中使用的溶剂(单剂或混合溶剂)习惯上称为洗脱剂，在薄层或纸色谱中使用时常称为展开剂。应根据被分离物质的组合和所选吸附剂的性质来考虑洗脱剂的选择。当分离的物质是弱极性物质时，通常选择弱极性溶剂作为洗脱剂。如果分离的物质是强极性组分，必须选择极性溶剂作为洗脱剂。如果对极性物质使用弱吸附的吸附剂(如硅藻土或滑石粉代替硅胶)，洗脱液的极性也必须相应降低。
在柱层操作中，可通过该方法加入分离的样品，或选择合适的溶剂溶解样品后加入。用于溶解样品的溶剂应具有较低的极性，以便分离出的成分可以被吸附。然后逐渐增加溶剂的极性。这种极性增加是一个非常缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在色谱柱上的组分被逐一洗脱。如果极性增加太多(梯度太大)，则不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力有时可以用溶剂的介电常数(ε)来表示。介电常数越高，洗脱能力越强。上述洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶和氧化铝。对于非极性吸附剂，如活性炭，顺序正好相反，在水或亲水性溶剂中形成的吸附作用强于脂溶性溶剂。
3.被分离物的性质:被分离物、吸附剂和洗脱液构成了吸附色谱中的三个要素，它们之间有着密切的联系。在特定的吸附剂和洗脱剂条件下，各组分的分离与被分离物质的结构和性质直接相关。对于极性吸附剂，组分极性大，吸附性强。
当然，中草药成分的整体分子观很重要。比如极性基团越多，吸附能越大，同系物中碳原子越少，吸附越强。简而言之，只要两种成分存在结构上的差异，就有可能分离，关键在于条件的选择。应该根据被分离物质的性质、吸附剂的吸附强度和溶剂的性质之间的关系来考虑。首先考虑被分离物质的极性。如果被分离的物质极性很小，是不含氧的萜烯，或者含有氧但非极性基团，就要选择吸附性强的吸附剂，用石油醚或苯等弱极性溶剂洗脱。而中药成分大多极性较大，需要选择吸附性能较弱的吸附剂(一般为ⅲ~ⅳ级)。所用洗脱剂的极性要按一定的梯度由小到大，或用薄层色谱法判断被分离物质在溶剂体系中的分离情况。此外，能否获得满意的分离也与选择的溶剂梯度密切相关。举例说明了吸附色谱中吸附剂、洗脱剂和样品极性之间的关系。如果有多组分混合物，如植物油和脂肪，则由烷烃、烯烃、醇酯、三醋精醋和脂肪酸组成。以硅胶为吸附剂时，选择一系列混合溶剂对吸附后的油进行洗脱，油中各单一组分可根据其极性依次洗脱。
再如C-27甾体皂甙元可按字中羟基数分离:将混合皂甙元溶于含5%氯仿的苯中，加入氧化铝吸附柱，用下列溶剂梯度洗脱。如果用吸附性弱的硅酸镁代替氧化铝，由于硅酸镁吸附性弱，洗脱液的极性要相应降低，即可以用苯或含5%氯仿的苯从吸附剂上洗脱单羟基皂苷元。这个例子说明了当相同的中草药成分在不同的吸附剂中进行色谱分离时，需要不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明了吸附剂、溶剂和待分离成分之间的关系。
(2)薄层色谱法:薄层色谱法是一种简单、快速、微量的色谱方法。一般将柱层析的吸附剂铺在玻璃片等平面上形成薄层，称为薄层层析。其原理与柱色谱法基本相似。
1.薄层色谱的特点:薄层色谱和柱色谱在应用和操作上的比较。
2.吸附剂的选择:薄层色谱吸附剂的选择原则与柱色谱相同。主要区别在于TLC要求吸附剂(支撑剂)的粒径更细，一般小于250目，粒径要均匀。薄层色谱所用的吸附剂或预制薄层的活性一般不要太高，ⅱ~ⅲ级为宜。扩散距离取决于薄层的颗粒大小。薄层粒径越细，展开距离越短，一般小于10 cm，否则可能造成色谱扩散，影响分离效果。
3.展开剂的选择:TLC，当吸附剂的活性达到一定值(如ⅱ级或ⅲ级)时，多组分样品的满意分离取决于展开剂的选择。在脂溶性成分中，中草药的化学成分按极性可分为非极性、弱极性、中等极性和强极性。但在实际工作中，往往需要利用溶剂的极性来调节显影剂的极性。4.特殊薄层:对于一些具有特殊性质的化合物的分离和检测，有时需要一些特殊的薄层。
①荧光薄层:当某些化合物无色，在紫外灯下不显示荧光，且没有合适的显色剂时，可在吸附剂中加入荧光物质，制成荧光薄层，用于色谱分析。展开后用紫外光照射，薄层板本身有荧光，但样品的斑点没有荧光，可以检测出样品的色谱位置。常用的荧光物质多为无机物。一种是硅酸锌，在254nm紫外光的激发下显示荧光，如锰激活清洗。另一种是硫化锌拨片，在365nm紫外光的激发下发出荧光，比如银活化。
②络合薄层:硝酸银薄层常用于分离一系列碳原子数相同但碳碳双键数不同的化合物，如不饱和醇、酸等。主要机理是碳碳键能与硝酸银形成络合物，而饱和碳碳键不与硝酸银络合。因此，在硝酸银薄层上，由于饱和度不同，化学物质可以分离。色谱中，饱和化合物因吸附最弱而呈Rf，一个双键的Rf值高于两个双键，一个三键的Rf值高于一个双键。此外，在双键平台中，与硝酸银的顺式络合比反式络合更容易。因此，它也可用于分离顺反异构体。
③酸碱薄层和PH缓冲薄层:为了改变吸附剂原有的酸碱性，可用稀酸或稀碱代替水配制薄层。比如硅胶是微酸性的，有时候不能很好的分离生物碱等碱性物质。如果不能铺展或拖尾，可以在铺薄层时用0.1 ~ 0.5nna0h的稀碱溶液做碱性硅胶薄层。例如，当用硅胶作吸附剂，用氯仿-丙酮-甲醇(8: 2: 1)作展开剂时，RF小于0.1，用同样的展开剂作碱性硅胶薄层，Rf值增加到0.4左右。说明毒扁豆碱是一种碱性生物碱。5.应用:薄层色谱主要用于中草药化学成分的研究，如化学成分的初步试验和鉴定，柱分离条件的探索等。
薄层色谱法对中药材化学成分的初步检验，可根据各种成分的性质和熟知的条件进行。由于在薄层上展开后可以分离出部分杂质，因此选择性高，预测试结果更可靠。
薄层色谱法鉴别中草药化学成分及标准样品。如果用几种溶剂展开后，标准物质和被证明物质的Rf值、斑点形状和颜色完全相同，则可以断定为同一化合物。但一般需要通过化学反应或红外光谱等仪器分析方法进行检查。
用薄层色谱法探索柱层分离条件是实验室的常规方法。进行柱分离时，首先要选择什么样的吸附剂和洗脱剂。在洗脱过程中，可以通过薄层分离来判断和检验每种成分将被洗脱的顺序以及每种洗脱液是单一成分还是混合物。通过薄层预分离，还可以了解多组分样品的组成和相对含量。如果在薄层上发现满意的分离条件，它们可以用于干柱色谱。然而，薄层的分离条件也可以适当改变，并通过通常用于下一层的洗脱转移到制备柱分离。用薄层预分离寻找柱层洗脱条件时，假设薄层上测得的Rf值为样品在柱层中的比迁移率(R)。这是因为薄层展开时，薄层固定相中所含的溶剂不断蒸发，使薄层上各点所含的溶剂量不相等，起始线附近的含量高于薄层前部。但如果严格控制色谱操作条件，可以得到接近真实值的Rf值。当元件被薄层隔开时，其Rf值范围一般为0.85 > RF > 0.05。此外，薄层色谱还应用于中药材品种、药材及其制剂的真伪检验、质量控制和资源调查。它是控制化学反应过程、检验反应副产物、分析中间体、检验化学品和制剂中的杂质、临床和生化检验以及分析毒物的有效手段。