贴壁细胞mtt检测的原理和方法有哪些？具体点，，，

MTT分析基于3-(4，5)-二甲基噻二唑(-z-y1)-3，5-二苯基四唑溴化物和MTT噻唑蓝。MTT是一种黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。它可以作用于活细胞线粒体中的呼吸链。在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，生成四氮唑环裂纹和蓝色甲状晶体。甲晶体的量只与活细胞数成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，MTT无法还原)。还原生成的甲晶体可溶于含50% N，N-二甲基甲酰胺和20%十二烷基硫酸钠(pH 4.7)的MTT溶液中，用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映活细胞数。也可以用DMSO溶解。

MTT粉剂和溶液存放时需要避光，用铝箔包裹即可。实验过程中，我一般会关掉超净台上的日光灯避光，这样比较好。

磁带引头

步骤如下:

1:细胞的接种:用含10%胎牛血清的培养液制备单细胞悬液，每个孔作为一个细胞悬液。

将1000-10000个细胞接种到96孔板中，每个板的体积为200ul。

2.培养细胞:与一般培养条件相同，培养3-5天(培养时间可根据实验目的和要求确定)。

3.染色:培养3-5天后，MTT溶液(5毫克/毫升，含PBS

继续孵育4小时，终止培养，并小心丢弃孔中的培养上清液。对于悬浮细胞，离心，然后丢弃孔中的培养上清液。向每个孔中加入150ul DMSO，摇动10分钟，使晶体完全熔化。

4.比色法:选择490nm波长，测量酶联免疫传感器上各孔的吸光值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

注意事项:

(1)选择合适的细胞接种浓度。

(2)避免血清干扰:一般选用胎牛血清小于10%的培养液进行试验。染色后尽量吸干孔内残留的培养液。

(3)设置空白对照:与实验平行的空白对照，不加细胞，只加培养液。其他测试步骤一致，最后比色法用空白调零。

MTT测试的吸光度最后应该在0-0.7之间，超过这个范围就不是线性关系了。

IC50为半抑制率，表示抑制率为50%时的药物浓度。将药物稀释至不同浓度，然后计算各自的抑制率，以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，得到50%抑制率时的药物浓度，即为IC50。要点:把药稀释两遍，多做梯度，做点图！

比如每组的浓度是0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，稀释倍数是10，浓度最大。代替

计算公式:

Pm=0.95

Pn=0.06

p = 0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06 = 3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI = LG 0.1/0.01 = 1

lgic 50 =-1-1 *(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025

有公式可以参考；

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg最大剂量

I:lg(最大剂量/邻近剂量)

p:阳性反应率的总和。

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

抑制率=1-给药组OD值/对照组OD值。

公式中最大和最小阳性反应率为最大和最小抑制率。

示例:

将在96孔板中培养的SMMC-7721肝癌用作MTT来测量细胞活力。1640培养基要加多少，MTT和DMSO加多少合适？根据书中记载，在加入200 UL 1640，20 UL MTT，150 ULD MSO之前，应尽可能去除培养基，以便于D MSO溶解的甲基丙烯酸甲酯颗粒的比色测定。

一般以每孔4000个细胞为宜，即细胞浓度为20000个细胞/ml，MTT加20ul，4小时后洗去上清液，注意不要洗去指甲，然后每孔加入150ul DMSO，在脱色摇床上摇动10分钟，然后测吸光度。

一般应低于IC50，以避免非凋亡细胞过多，流式细胞仪检测片段过多。我一般用1/2-1/3的IC50，36h。一般情况下，空白处理的肿瘤细胞系凋亡率应低于1%，处理后一般为5-10%(Annexin V)，细胞周期的亚G0峰明显。