如何用ph梯度萃取法从大黄中提取分离蒽醌
大黄中有几种具有泻下作用的蒽醌衍生物，其中苷类是主要成分，因为其泻下作用往往强于相应的苷元，苷元主要有大黄酚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚。大黄的泻下作用与结合大黄酸的含量成正比。游离蒽醌苷元几乎没有致泻作用。具有强致泻作用的蒽醌苷有几种:大黄酚-1-葡萄糖苷、大黄素-6-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-葡萄糖苷、大黄酸-8-葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷，以及含有蒽醌衍生物的二糖，如大黄素二葡萄糖苷、芦荟大黄素二葡萄糖苷、大黄酚二葡萄糖苷和番泻苷。近年来，日本人西冈武夫分离出大黄泻的四种新成分，称为大黄酸A、B、C、d，除此之外，还含有大黄鞣酸及相关物质。比如没食子酸(一部分是游离的，一部分结合成没食子糖苷)、儿茶精、鞣质及相关物质都有止泻作用，这与蒽醌类衍生物的止泻作用正好相反。
1，大黄酚
金色片状晶体。Mp196℃(乙醇或苯)可升华，溶于丙酮、乙酸、氯仿、甲醇、乙醇和热苯，微溶于石油醚和乙醚，不溶于水，溶于NaOH溶液。
2.大黄素
橙黄色针状晶体在MP 256 ~ 257℃(乙醇或冰醋酸)下可升华，其溶解度为乙醚0.14%，苯0.041%，氯仿0.0718%。几乎不溶于水，溶于乙醇，溶于稀氨水和Na2CO3水溶液。大黄素对小鼠黑色素瘤和乳腺腺瘤有抑制作用。
3.芦荟素
黄色针状结晶，MP 223 ~ 224℃(甲苯)可升华，溶于乙醚、苯、热乙醇、稀氨水、Na2CO3、NaOH水溶液。
4.莱茵河
黄色针状晶体，MP 321 ~ 322℃(升华)。不溶于水，溶于吡啶和碳酸氢钠水溶液，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚。大黄酸能抑制艾氏腹水癌。
5、大黄素甲醚(Physcion)
红色针状结晶mp206℃(苯)可以升华。溶解度类似大黄酚。
6.羟基蒽醌苷
①大黄素甲醚单葡萄糖苷(大黄素甲醚单葡萄糖苷)
黄色针状晶体mp235℃
②芦荟大黄素单葡萄糖苷。
mp239℃
③大黄素单葡萄糖苷。
MP 190 ~ 191℃淡黄色针状结晶
④大黄酸单葡萄糖苷。
mp266~270℃
⑤大黄酚葡萄糖苷(大黄酚葡萄糖苷)
mp245~246℃
⑥大黄素-l-O-β-D-葡萄糖苷(1-0-β-D-吡喃葡萄糖基大黄素)
mp239~241℃
⑦芦荟大黄素(w-o-β-d-吡喃葡萄糖基芦荟大黄素)
mp187~189℃
8大黄酸苷a、b、c、d
大黄酸A: R = OH大黄酸B: R = OH
大黄酸c: r = h
根据大黄中蒽醌苷在酸性条件下加热可水解成游离羟基蒽醌和糖，而游离羟基蒽醌不溶于水，溶于乙醚、氯仿等亲脂性有机溶剂的性质，本实验从水解液中提取游离羟基蒽醌，再用pH梯度萃取法分离。游离蒽醌也可以通过使用不同极性的硅胶柱色谱分离。
仪器、材料和试剂
仪器:500mL圆底烧瓶、烧杯、滴管、橡胶管、球形冷凝器(750px)色谱筒、样品瓶、索氏提取器、250mL分液漏斗、布氏漏斗、吸滤瓶、普通滤纸、薄层板、喷雾器、大量PH试纸。
材料和试剂:大黄10~20g ~ 20g、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、硫酸、氨水、盐酸、乙醚、石油醚、乙酸乙酯。
实验步骤
1.游离蒽醌的提取
称取50克大黄粗粉，加入150毫升20%H2SO4水溶液，水浴加热3-4小时，冷却，抽滤，用水洗涤滤饼至近中性，抽滤，70℃干燥，粉碎，置于索氏提取器中，加入150毫升乙醚回流提取3-4小时，得到乙醚提取物。
乙醚提取物经TLC鉴定为大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶—CNC粘合板，展开剂为石油醚(60 ~ 90℃):乙酸乙酯(7: 3)，近水平或垂直展开。在可见光下，可以看到四个斑点。Rf=0.9的黄色斑点是大黄酚和大黄素甲醚的混合物，在此条件下无法分离。另外三个斑点按照Rf值的顺序分别是大黄素(橘色斑点)、芦荟大黄素(黄色斑点)、大黄酸(黄色斑点)。
2.PH梯度萃取分离
(1)将乙醚提取物加入250mL分液漏斗中，并用40ml 2.5% nah co 3水溶液提取三次。通过薄层色谱(TLC条件)检查乙醚层，表明大黄酸是从乙醚提取物中提取的，然后将三种nahco3提取物合并并用浓盐酸酸化以获得大黄酸沉淀。(注意:加酸时要慢慢加，防止酸溢出)
(2)用2.5% NaHCO3水溶液提取的乙醚层用2.5% NaHCO3水溶液提取三次，每次40mL，并通过薄层色谱检查乙醚层。结果表明，大黄素提取完全后，Na2CO3提取液合并三次，酸化得到大黄素沉淀。(酸化时注意操作同前)用2.5% Na2CO3水溶液萃取的乙醚溶液用2.5% Na2CO3水溶液萃取约四次，每次30mL。薄层检查表明芦荟大黄素提取完全，合并四次提取液，酸化，得到芦荟大黄素沉淀。(如前所述，注意酸化期间的操作)
(3)乙醚层用2.5% Na2CO3水溶液萃取后，再用2.5% NaOH水溶液萃取至碱性水层无色(约4次)，每次50毫升，合并NaOH萃取液，酸化，得沉淀。过滤并用水洗涤，直至洗出液呈中性。低温干燥后，溶于小体积石油醚中，作为柱色谱的样品溶液。通过TLC分析，样品溶液具有黄色斑点(大黄酚和大黄素甲醚混合物的斑点)。如果使用以下纸色谱条件，两者可以分离。
纸层析条件:新华滤纸7×20(cm)
展开剂:水饱和石油醚(BP 60 ~ 90℃)
扩展模式:升序方式
显色剂:4%NaOH乙醇溶液。
3.纤维素粉柱色谱法分离大黄酚和大黄素甲醚。
(1)纤维素粉末的制备；
将新华滤纸(或其纸片)切成小块，称15g，加入300 ml稀硝酸(每100mL水加入5ml 65-68%硝酸)，加热水解(约2小时)，抽滤(G3耐酸漏斗)，用蒸馏水洗涤滤饼至中性，然后加入少量乙醇和乙醚依次逐一洗涤。
(2)柱填充:将约8g纤维素粉末用水泡眼和石油醚(BP 60 ~ 90℃)湿法填充。
(3)上样:用移液管小心地将样品溶液加入色谱柱床的顶部。
(4)洗脱:用水泡和石油醚(BP 60 ~ 90℃)洗脱，分段收集，每份10mL，分别浓缩，纸层析检查(纸层析条件同上)，合并相同的，分别收集大黄酚和大黄素甲醚。用乙酸乙酯重结晶后测定大黄酚的熔点。
4.大黄酚的鉴别
(1)用薄层板上的点滴反应检查大黄酚对NaOH和MgAc2试液的反应。
(2)大黄酚紫外光谱的测定。
(3)用溴化钾压片法测定大黄酚的红外光谱。