碘试验的准备

系统预试验法——利用一些简单的定性试验，全面检查中药中的各种化学成分。

单项预检验法——根据需要，重点对某一类成分或某一有效成分进行检验。

方法:试管反应+薄层色谱检查。

中草药主要来自植物。植物的化学成分复杂，有些成分是在植物中发现的，如纤维素、蛋白质、油脂、淀粉、糖、色素等。有些成分是某些植物所特有的，如生物碱、苷类、挥发油、有机酸、鞣质等。

各种化学成分都有一定的特性。一般药材的外观、色、香、味可以作为初步检验判断的手段之一。如药材样品破碎，切片不油或挤压后有油痕，则含油脂或挥发油较多；有粉层的含有淀粉和糖；有特殊气味者，多含挥发油、香豆素、内酯；有甜奈者含糖量多；大多含有生物碱、苷类和苦味；味道酸的含有有机酸；有涩味的含有单宁等。

中草药中所含的化学成分是多种多样的混合物，在分析时往往相互干扰，很难得到正确的结果。因此，需要根据中药材的溶解度、酸碱度、极性等理化性质来鉴别中药材中所含的化学成分，然后通过各种成分的鉴别反应来进行鉴别。

一、试验前溶液的制备

1，水提取物-糖、多糖、有机酸、皂甙、酚、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质...

2、乙醇提取物——酚类、鞣质、有机酸、香豆素、强心苷、黄酮类、蒽醌、类固醇...

3，5%盐酸-乙醇提取物-生物碱

4、石油醚提取物——类固醇、萜类、脂肪油...

(1)鉴定注意事项

1.根据灰分成分的不同性质，选择合适的溶剂进行提取，确保成分能够被提取出来。

2.样品提取物的浓度应足以达到每个反应的灵敏度。

3.样品提取液的pH值不应影响鉴定反应所需的pH值。如果差异较大，应提前调整。

4.提取液较深时，常影响观察和鉴别反应的效果，可适当稀释或进一步纯化。

5.在鉴别反应过程中，应注意防止各种成分的干扰，以免出现假阳性或颜色不正确。化学鉴定的同时最好做空白试验和对照试验(用已知含有某种成分的中药材或纯品作为阳性对照)。

6.在鉴别试验中，如果某一成分的几种鉴别反应结果不一致(即有的是阳性有的是阴性)，应进行综合分析。第一，要注意阳性反应的试验是否属于这种成分的特定反应，否则要检查其他成分是否能产生这种反应，从多方面进行判断。但也要注意，有些反应只能对某个组分中的某个化学基团发生反应。比如黄酮类化合物的盐酸-镁粉试验表明，它只对黄酮类化合物中的羟基黄酮类化合物(黄酮醇)反应明显，其他黄酮类化合物不明显，但不能轻易否认不是黄酮类化合物。为了避免孤立和片面的结论，必须考虑全面的分析。

中药材化学成分的一般鉴别试验只是初步判断，最终确认还需要进一步提纯才能肯定。

(2)识别方法

1，氨基酸，肽，蛋白质。

(1)加热沉淀试验:加热至沸腾→混浊或沉淀(蛋白质)

+5%H2SO4(未加热)→混浊或沉淀

(2)缩二脲试验:+40%NaOH，1%CuSO4 →紫色、红色或紫红色(多肽、蛋白质)。

(3)茚三酮反应:+0.2%茚三酮试液→蓝色或紫蓝色(氨基酸、多肽、蛋白质)。

(4)靛醌反应:+靛醌试液→各种颜色(氨基酸)

(5)米隆反应:+Hg，H2NO2 →红色(蛋白质分子中含有酪氨酸)。

(6)霍普金斯-科尔反应:+乙醛酸、浓硫酸→各种颜色(蛋白质分子由色氨酸组成)。

(7)氨基酸的薄层色谱检查:吸附剂-硅胶g

显影剂-正邦，正邦:HAC: H2O

显色剂-0.25%茚三酮试液→紫色斑点

(1)加热或无机酸试验:在试管中取1毫升样品水溶液，加热至沸腾或加入5%盐酸。如果出现浑浊或沉淀，说明含有水溶性蛋白质。

(2)缩二脲试验:取1ml供试品水溶液，加入2滴10%氧化钠溶液，摇匀，逐渐加入硫酸铜试液，与之摇匀，并注意观察。如果呈紫色或紫红色，可能含有蛋白质和氨基酸。

所有的蛋白质结构都含有两个或两个以上的肽键(- CONH -)，在碱性溶液中能与Cu2+反应生成仙女络合物，表现出一系列的显色反应。二肽是蓝色的，三肽是紫色的，加了肽就是红色的。肽键越多，颜色越红。

(3)茚三酮试验:取65438±0ml样品水溶液，加入2-3滴茚三酮试液，加热煮沸4-5分钟，冷却至变成红棕色或蓝紫色(蛋白质、蛋白胨、肽和氨基酸)。

氨基酸与茚三酮反应，其酸被氧化成醛、氨和二氧化碳，茚三酮被还原成仲醇，仲醇与氨和另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色化合物。

注①茚三酮试剂主要是多肽和氨基酸的显色剂，在1小时内反应稳定。试剂溶液的pH值为5-7，必要时可加入几滴吡啶或乙酸钠进行调节。②这种反应非常敏感，但有些氨基酸是黄色而不是紫色，比如脯氨酸。

(4)氨基酸薄层色谱检测反应:

①吸附剂:硅胶g

②展开剂:(1)正丁醇:水(1: 1) (2)正丁醇:乙酸:水(4: 1: 5)。

③着色剂:0.5%茚三酮丙酮溶液，喷洒后置于1100烘箱中5分钟，呈蓝紫色或紫色。

2.皂甙

(1)泡沫端测试:摇动→大量持续性泡沫端。

泡末高度相同的+0.1M HCl(三萜皂苷)

+0.1M NaOH碱管高于酸管(甾体皂甙)。

(2)溶血试验:+2%红细胞悬液→溶血。

(3) Lieberman-Burchard反应:+乙酸酐-浓硫酸-紫红色(三萜皂苷)

黄色-红色-紫色-污绿色(甾体皂甙)

(1)泡沫试验:取2ml样品水溶液于带塞试管中，用力摇动3min，以生成永久蜂窝状泡沫(维持10分钟以上)，泡沫量不少于液体体积的1/3。

注意常用的增溶剂吐温和司盘在摇动时会产生持续的泡沫，要注意区别。

(2)溶血试验:取4支试管，分别加入0.25 ml、0.5 ml、0.75 ml滤液，然后依次加入2.25 ml、2.0 ml、1.75 ml、1.5 ml生理盐水，使每支试管中的溶液变为2.5ml，再向每支试管中加入2.5ml的2%血细胞悬液。放在370-浴槽或25-270℃的室温下观察溶血情况，一般为3小时，或先在显微镜下滴下红细胞，再加入试液，看血细胞是否消失。如果有溶血，则显示阳性反应。

注①单宁能凝集红细胞，干扰溶血试验的观察。要提前去除(可以用丙烯酰胺粉末吸附，也可以用明胶沉淀)。②试液应呈中性。

(3)乙酸酐浓硫酸试验(Liebrmann Burchard反应)取样品水溶液置于蒸发皿中，水浴上蒸发，残渣加入少量冰醋酸使其溶解，再加入乙酸酐浓硫酸(19: 1)试液，试液呈红紫色，变为污绿色(甾体、三萜或皂苷)。

(4)区分甾体皂苷和三萜皂苷:取两个带塞子的试管，每个样品65438±0ml溶于水中，将2ml 0.65438±0n盐酸溶液加入另一个试管的65438±0ml 0.65438±0n氢氧化钠溶液中，用力摇动65438±0min(左右手应交替摇动半分钟)，观察两个试管的泡沫。如果碱管里的泡沫比酸管里的多，说明是甾体皂甙。

三萜皂苷是一种酸性皂苷，在酸性水溶液中形成稳定的泡沫；甾体皂甙是中性皂甙，在碱性溶液中能形成稳定的泡沫。

浓硫酸、高氯酸、高氯酸-香草醛、浓硫酸-香草醛等的显色原理。主要是将羧基脱水，增加双键结构，然后通过双键置换、双分子缩合等反应生成* * *轭双键体系，再在酸的作用下形成阳离子碳离子盐显色。

3.糖和糖苷

(1)林飞试剂:+硫酸铜，酒石酸钾钠-砖红色沉淀(还原糖)

(-)+1% HCl+NaOH沉淀(苷元)

△30分钟上清液(+)(多糖、苷)

(2)莫利什反应:+α-萘酚-浓硫酸→品红色环。

(3)银镜反应:+0.1N硝酸银，5N氨→银棕色(还原糖)

(4)薄层色谱检查:吸附剂-硅胶G或纤维素。

显影剂:正丁醇:钯:buoh15%HAc

显色剂-苯胺-邻苯二甲酸

(1)碱性酒石酸铜试液:取1-2ml供试品水溶液(若为醇溶液，必须将醇蒸发)，加入1-2ml碱性酒石酸铜试液，沸水浴中加热5min，产生棕红色或砖红色氧化亚铜沉淀，指示还原糖。

还原糖可将铜盐(蓝色)还原为氧化亚铜，醛糖的醛基氧化为羧基；

注①如果试液呈酸性，应先碱化。②由于条件不同，该反应生成的沉淀颜色不同。粒子是黄色的，粒子是红色的。当有滞留胶体时，常产生黄色沉淀。③样品中含有其他具有强还原性的醛、酮等成分，或药物制剂中添加的抗氧化剂。葡萄糖等可以是阳性。

(2)α萘酚试验(莫利施紫环反应):取1ml供试品水溶液，加入几滴5%萘酚试液并摇匀，然后沿管壁滴加5-6滴浓硫酸，形成两液层，2-3分钟后，两液层上出现紫环(糖、多糖或糖苷)。

多糖用浓硫酸水解成单糖，单糖用浓硫酸脱水生成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与α萘酚反应生成紫红色缩合物。

注①糖苷的分子结构中含有糖基，一般属于单糖，如葡萄糖、鼠李糖、半乳糖，但也含有二糖(二糖)或多糖(多糖)。在上述反应条件下，糖苷水解成单糖，因此糖苷的萘酚试验就是分子中的糖部分的反应。②由于这种反应比较敏感，如果溶液中有少量滤纸纤维或中草药粉末存在，即可产生上述反应。

(3)多糖的确证试验:取5ml样品水溶液蒸干，加入1ml蒸馏水，5ml乙醇。如果出现沉淀，过滤收集，然后用少量热乙醇洗涤，再将沉淀溶于3ml蒸馏水中，做如下试验。

①碘试验:取65438±0ml样品非溶液，加入65438±0滴碘试液，观察颜色变化。如果是蓝黑色，就是地衣糖；紫黑色是糊精；加热时蓝色消失，冷却后重新呈现淀粉状。

②用多糖水取1ml供试品水溶液，加入5滴稀盐酸，在沸水浴中加热10-15min，然后用10%氢氧化钠溶液中和至中性，加入4滴新配制的碱性酒石酸铜供试品，取1ml供试品溶液，不经酸水解直接加入供试品。

多糖水解产生单糖，通过还原单糖将铜离子还原成氧化亚铜。

4.酚类和单宁

(1)FeCl3试剂:+1%FeCl3试液→蓝色、深绿色或蓝紫色。

(2)氯化铁-铁氰化钾试剂:喷洒→蓝点。

(3)香草醛-盐酸试剂:喷雾→红色(间苯二酚、间苯三酚)

(4)重氮盐试剂:+对硝基苯胺，亚硝酸钠→红色。

(5)薄层色谱检查:吸附剂-硅胶G或纤维素。

显像剂-正邦:HAC:H2O；15%HAc

显色剂-1% FeCl _ 3试液

1%氯化铁-1%铁氰化钾试液→蓝色、绿色或黑色。

单宁和酚类的区别:+明胶-沉淀

上清液+1%FeCl3试液→蓝色、深绿色或蓝紫色。

(1)三氯化铁试验:取1ml样品水溶液，加入1-2滴三氯化铁试液，呈绿色、污绿色、蓝黑色或深紫色(可水解鞣质呈蓝-蓝-黑色，缩合鞣制呈绿色-污绿色)。

单宁是多元酚的衍生物，能与三价铁离子反应生成复盐。

注意:如果该反应中存在无机酸、有机酸和醋酸盐，会阻碍颜色的形成。硝基酚对氯化铁试剂无明显反应。

(2)明胶试验:取1毫升样品水溶液，加入2-3滴氯化钠溶液，产生白色沉淀。

丹宁酸具有凝结蛋白质的特性。

(3)溴试验:取1ml供试品水溶液，加入1-2滴溴试液，产生白色或沉淀，说明可能含有苯酚或儿茶酚鞣质。

溴太多会阻碍单宁的沉淀，所以不宜多加溴水。

(4)香草醛-酸试验:将样品水溶液点于滤纸上，干燥后，喷或滴香草醛-盐酸试液，显示红色斑点(多酚)。

(5)薄层色谱法检测鞣质和酚类物质:

①吸附剂:聚酰胺；硅胶；硅胶；将石膏:水(5: 1: 7)混合，涂覆成薄板，并在1050下干燥45分钟。

②展开剂:乙醇:乙酸(100:2)；正丁醇:乙酸乙酯:水(5:4:1)；苯:甲醇(95: 5)。

③着色剂:10%氯化铁溶液；1%氯化铁乙醇溶液和1%铁氰化钾水溶液(1: 1)呈蓝紫色斑点。

5.黄酮类化合物及其糖苷

(1)盐酸-镁粉反应:+HCl-Mg →红色。

(2)三氯化铝反应:+AlCl3 →黄色

(3)浓氨反应:+NH3 →亮黄色或橙色。

(4)薄层色谱检查:吸附剂-聚酰胺或硅胶g

(1)单镁(或锌)盐酸盐粉末试验:取1ml样品的乙醇溶液，加入少量镁粉(或锌粉)，然后加入4-5滴浓盐酸，在沸水浴中加热2-3分钟。如果变红，说明是游离的黄酮或黄酮苷(采取同样的方法，不加镁或粉末作为对照，如果两管都变红，就。

在盐酸存在下，黄酮类化合物的乙醇溶液可被镁粉还原生成花色苷，花色苷呈红色或紫色反应(部分呈淡黄色、橙色、紫色或蓝色)。这是因为酮类化合物的分子中含有一个碱性氧原子，可溶于稀酸中还原成四价氧原子，即锌盐。这种方法是一种鉴别黄酮类化合物的反应。但是花青素本身是酸红色的(不加镁粉)。

注①此反应仅在化学结构上，三位羟基的酮醇显色明显，其他黄酮和烷酮不明显。所以不能下否定反应的结论，要结合其他实验才能下结论。②实验要在酒精中进行，水多了会影响颜色的形成。这个反应比较慢，有时需要水浴加热来促进反应。

(2)荧光测试:

①三氯化铝试验:将样品的乙醇溶液点于滤纸上(干燥后点1次，使其浓度适中)，干燥后喷1%三氯化铝乙醇试液，紫外灯下观察，呈黄色、绿色、橙色等荧光为黄酮类；显示天蓝色或黄绿色；荧光是二氢黄酮，是区分二氢黄酮的鉴别反应。

②硼酸丙酮柠檬酸丙酮试验:取1ml样品的乙醇溶液，蒸发加入0.5ml饱和硼酸丙酮溶液和0.5ml 10%柠檬酸丙酮溶液，在紫外灯下观察，试管呈强绿色荧光(黄酮类或其苷类)。

(3)碱性溶液试验:取样品的乙醇溶液点在滤纸上(干燥后，再点一次以浓缩其溶液)。干燥后，喷入1%碳酸钠溶液或在氨蒸气中熏几分钟，呈亮黄色、绿色或橙黄色。如果氨水熏过的滤纸暴露在空气中，颜色会逐渐褪色，变成原来的颜色(黄酮或其)。

5.生物碱类

(1)沉淀反应-碘化钾汞试剂→白色或淡黄色沉淀

碘化铋钾试剂→橙色沉淀

碘-碘化钾试剂→浅棕色或深棕色沉淀

硅钨酸试剂→淡黄色或黄褐色沉淀

磷钨酸试剂→淡黄色沉淀

磷钼酸试剂→白色或淡黄色沉淀

苦味酸试剂→黄色结晶或无定形沉淀

单宁酸试剂→棕黄色沉淀

氯化金试剂→黄色结晶

氯化铂试剂→白色结晶

红色铵盐→红色无定形沉淀

(2) TLC检查:吸收剂-碱性氧化铝(ⅲ级，干铺)

硅胶g(稀碱湿铺)

展开剂-氯仿:甲醇

显色-紫外线；碘化铋钾

6.有机酸

(1)PH试纸检验

(2)溴酚蓝试液:喷雾→蓝色背景上的黄色斑点。

(3)薄层色谱检查:吸附剂-硅胶G或酸性氧化铝。

展开剂—— C6H6:乙醇

显色试剂-0.1%溴酚蓝试液→黄色

7.类固醇

(1)利伯曼-伯查德反应:+乙酸酐-浓硫酸→黄色-红色-紫色-污绿色。

(2)氯仿-浓硫酸反应:+氯仿-浓硫酸氯仿层→红色或青色。

硫酸层→绿色荧光

(3)五氯化锑或三氯化锑的反应:+SbCl3或SbCl5 →红色。

(4)薄层色谱检查:吸收剂-中性氧化铝或硅胶g

展开剂-c6h 6-MeOH；氯仿甲醇

显色剂-10%磷钼酸→蓝-蓝紫色

5%三氯化锑试液→红色、棕红色或绿色

9、香豆素、内酯

(1)开闭环反应:+1%NaOH→澄清+2%HCl→混浊。

(2)氢氧酸铁的反应:+7%盐酸羟胺，10% KOH△+稀HCl，1%FeCl3 →红色。

(3)重氮盐试剂:+对硝基苯胺，亚硝酸钠→红色。

(4)薄层色谱检查:吸附剂-酸性硅胶G或硅胶G或酸性氧化铝。

展开剂-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5: 4: 1)

显色剂-紫外→蓝色荧光

铁氢氧酸盐测试溶液→红色

10，强心苷

(1)凯德试剂:+3，5-二硝基苯甲酸试液→紫红色

(2)巴尔杰试剂:+碱性苦味酸试液→橙色或橙红色。

(3)法定试剂:+亚硝酰铁氰化钠试液→紫红色。

(4)K-K反应:+FeCl _ 3/冰HAc，浓H2SO4→上绿~蓝(2-脱氧糖)

界面红棕色

(5)薄层色谱检查:吸附剂-硅胶G或中性氧化铝。

展开剂:正丁醇:醋酸:H2O (4: 1: 5)

显色剂-碱性3，5-二硝基苯甲酸试液→紫红色

碱性苦味酸试液→橙红色

11，蒽醌

(1)碱性溶液反应:+10%NaOH →红色+H2O2 →红色不褪色+H+ →红色褪色。

(2)醋酸镁反应:+1%MgAc2 →红色。

(3)薄层色谱检查:吸附剂-硅胶g

显影剂-pet:乙酸乙酯

显色剂-紫外→黄色荧光

5%氢氧化钠→红色

12，挥发性油，油脂

(1)油斑检查:油斑挥发→挥发油；油斑不消失→油脂或脂质。

(2)磷钼酸反应:喷5%磷钼酸试液→蓝色(油、三萜、甾醇)

最后，需要特别提醒的是，以上试剂的配制方法最好参考药典。第一个原因是写的很详细，第二个原因是药典里有规定，药典里配制的溶液如果用乙醇，如果没有规定无水乙醇，一般用95%的乙醇。

此外，附上试剂匹配方法:

氯化钠明胶试剂:(两者都是固体，刚开始真的不知道怎么混，后来在药典上找到了配方)现在需要准备2g氯化钠和1g明胶，加上100g水！