本实验采用有机溶剂纯化多糖。有没有替代的试剂或者方法？
另外，多糖作为一种药物，毒性很小，因此对多糖的研究引起了人们极大的兴趣。
由于多糖的生物活性与其结构密切相关，而多糖的结构又相当复杂，这方面的研究相对较慢。然而，人们在多糖的分离、提取和纯化方面做了大量的工作。
1.多糖的提取[12]
1.1热水提取法:
1.1.1多糖提取条件的优化
根据文献报道[13]，热水提取多糖的主要影响因素有提取时间、提取次数、溶剂体积、提取温度、pH值、醇沉浓度和植物粒度。实验前，通过正交实验对上述因素进行优化，选出最佳提取方案。
1.1.2其步骤为:原料→粉碎→脱脂→粗提(2-3次)→抽滤或离心→沉淀→洗涤→干燥。
首先，去除表面脂肪。原料粉碎后，加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或乙醇和乙醚的混合溶液1∶1，水浴加热搅拌或回流1-3小时。脱脂后过滤得到的残渣一般用作溶剂(氢氧化钾碱性水溶液、氯化钠水溶液、1%醋酸、1%苯酚也可。控制温度在90-100℃，搅拌4-6小时，反复提取2-3次。大多数多糖提取物是粘性的，可以通过抽吸过滤。也可通过离心去除不溶性杂质，将滤液或上清液混合(所得多糖如呈碱性需中和)。然后浓缩，加入2-5倍量的低级醇(甲醇或乙醇)沉淀多糖；还可加入铁试剂溶液、硫酸铵或十六烷基三甲基溴化铵与多糖结合，生成不溶性复合物或盐沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗涤后的松散多糖迅速转移到装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中进行真空干燥(如果沉淀出的多糖呈胶状或粘稠状，可直接冻干)。干燥后可得到粉末状粗多糖。
1.2微波辅助提取法:
其原理是利用不同极性介质对微波能量的不同吸收程度，选择性地加热基质中的某些区域和萃取体系中的某些组分，使被萃取物质从基质或体系中分离出来，进入介电常数小、微波吸收能力差的萃取剂中[14]。
由于微波可以大大加速细胞壁的破裂，因此可以大大加快中草药有效成分的提取速度，提高提取得率。而且由于选择性好，萃取后基质能保持良好的性质，萃取物比一般的萃取方法更清晰[15]。
聂金元等人比较了微波辅助提取法、超声波辅助提取法和索氏提取法在柴胡多糖和黄酮提取中的作用[18]，发现微波辅助提取法所需时间最短(10min)，多糖提取率最高(28.46%)。
1.3超声波辅助法:
其原理是利用超声波空化作用加速植物有效成分的提取，而超声波的机械振动、乳化、扩散、粉碎、化学作用等次级效应，也能加速待提取成分的扩散释放，并与溶剂充分混合，有利于提取[16]。
与常规提取方法相比，超声波辅助提取法具有提取时间短、得率高、无需加热等优点[17]。
1.4索氏提取法:
将植物粉末放入索氏提取器中，加入石油醚，在60℃-90℃提取至无色(一般6小时)。过滤，待溶剂挥发干燥后，加入80%乙醇，提取6小时，过滤，将滤渣中的乙醇挥发干燥，加入蒸馏水。回流提取两次，趁热过滤，滤液减压浓缩，去蛋白，醇沉，去色素。在60℃下干燥；c和称重。
1.5酒精提取:
将90%和50%的乙醇相继加入到植物粉末中，充分摇动混合物，然后过滤。向滤液中加入足够的无水乙醇，并在4℃的冰箱中放置过夜。真空过滤，除去色素，得到粗多糖，在通风干燥箱中60℃干燥，在干燥盘中恒重保存。
醇提法简单易操作，但提取率低，乙醇用量大，不适合大规模提取。
1.6其他方法:
多糖的提取方法有稀碱溶液提取法、稀酸溶液提取法、酶法等。但在稀酸和稀碱条件下，多糖的糖苷键容易断裂，部分多糖水解，降低了多糖的提取率。所以很多实验都避免稀碱溶液萃取和稀酸溶液萃取。
2.多糖的纯化
2.1多糖中杂质的去除方法粗多糖中常混有蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别去除。
2.1.1蛋白质除外
通过醇沉淀或其他溶剂沉淀获得的多糖通常与更多的蛋白质混合。去除蛋白质的方法很多:如选择苯酚、氯仿、单宁等能沉淀蛋白质而不能沉淀多糖的试剂，但酸性试剂要短，温度要低，避免多糖降解。常用的方法有[19]:
2.1.1.1精明积法(Sevag法)[20]:根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性而不溶于水的特性，将多糖水溶液、氯仿、戊醇(或正丁醇)的比例调整为25:5:1或25: 4: 650。这种方法温和，对避免降解有很好的效果，但效率不高。比如五味子多糖的提取实验，要重复30多次。并且每次去除蛋白质变性胶体时，不可避免的会有少量多糖溶解，在处理过程中会有少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白沉淀，造成多糖的损失。如果能加入一些蛋白质水解酶，Sevage法更好。
2.1.1.2三氟三氯乙烷法[21]:将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌约10min，离心取上层水层，水层按上述方法处理数次，得到不含蛋白质的多糖溶液。这种方法效率高，但溶剂沸点低，易挥发，不适合大规模应用。
2.1.1.3三氯乙酸法:向多糖水溶液中滴加5%-30%的三氯乙酸至溶液不再浑浊，在5-10℃放置过夜，离心除去沉淀，得到无蛋白多糖溶液。这种方法会引起一些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法都不适合糖肽，因为糖肽会像蛋白质一样沉淀出来。对于碱稳定的糖蛋白，这种结合蛋白可以通过在硼氢化钾存在下用稀碱温和处理来分离[1]。
2.1.1.4酶水解[22]:蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等。添加到样品溶液中以降解样品中的蛋白质。一般与Sevag法结合使用去蛋白效果更好。
2.1.1.5盐酸法[23]:取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，静置过夜，3000r/min离心，弃去沉淀，即除去蛋白质。
另外，李志敏[23]和叶江宇[25]等人分别证明盐酸法、三氯乙酸法和Sevag法的脱蛋白率分别为72.5%、46.1%和42.3%，多糖损失率分别为15.1%和6.65438+。盐酸法脱蛋白率高，但多糖损失率也高。三氯乙酸法温和，但蛋白质去除效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不如前两种。
2.1.1.6其他方法:可加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba(OH)2溶液，摇匀后离心除去蛋白质。这种方法去除蛋白质不够彻底，可以和Sevag法结合使用。或者，可以向提取液中加入50%的TCA溶液，直到沉淀完全，并且可以通过以4000转/分钟离心65438±00分钟来收集上清液，其为去蛋白溶液。还有的用4:1的氯仿-乙醇溶液去蛋白，摇匀混合液，然后静置，取上清液。这个过程需要重复很多次，才能去除蛋白质。
用紫外分光光度计检查除去蛋白质的样品，并观察在280mm处是否有吸收。如果没有吸收，则表明蛋白质已被清除[24]。
2.1.2脱色素
2.1.2.1脱色素活性炭[12]:活性炭是一种非极性吸附剂，吸附能力很强，特别适用于水溶性物质的分离。它来源丰富，价格便宜，柱装载量大，适合大量制备分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末活性炭、颗粒活性炭和尼龙活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，导致多糖流失。
2.1.2.2对于植物来源的多糖，它们可能含有酚类化合物，颜色较深。这些色素多为负离子，活性炭吸附剂无法脱色。弱碱性树脂DEAE纤维素或Duolitea-7可用于吸附色素。
2.1.2.3如果糖与色素结合，很容易被DEAE纤维素吸收，不能用水洗脱。这种色素可以氧化脱色:用浓氨水或NaOH溶液调节pH值至PH8.0左右，滴加H2O2至50℃以下呈淡黄色，保温2小时。
2.1.2.4依次用丙酮、无水乙醚、无水乙醇洗涤多糖，得到较纯的多糖。该方法简单易操作，多糖损失也小。
2.1.2.5用4:1的氯仿-正丁醇除去色素。操作简单，多糖有一定损失。
2.1.2.6一般发酵得到的多糖颜色较浅，色素含量较少，一般不需要去除色素。
2.1.2.7从动物和微生物中提取的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。
2.1.3去除低聚糖等小分子杂质
2.1.3.1采用反向流水透析法。也就是准备一桶蒸馏水，用一根导管将水引入透析袋的烧杯底部，用另一根导管将水导出，根据水量控制流速，让水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半成品。
2.1.3.2利用溶液浓度的扩散效应，将无机盐、低聚糖等分子量小的物质渗透到透析袋外的蒸馏水中，通过不断换水来维持浓度差，从而去除小分子杂质。具体方法是根据多糖溶液的体积剪下相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，注入多糖溶液，将透析袋夹在离液面2-3 cm处，放入大烧杯中，注入蒸馏水至透析袋完全浸没，用磁力搅拌器缓慢搅拌，每12小时换水一次，重复3-4次。
2.2多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离成单一多糖的过程。净化方法主要包括以下几种:
2.2.1分级沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中溶解度不同的性质，按从小到大的比例依次加入甲醇、乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀物。经过反复溶解沉淀，测得的物理常数是常数(最常用的是比旋度测定或电泳检查)。该方法适用于不同溶解度多糖的分离。为了稳定多糖，通常在pH7下进行。只有酸性多糖在pH7时以-COOH′离子的形式存在，所以需要在pH 2-4时分离。为了防止糖苷键水解，操作应迅速。此外，多糖还可以制成各种衍生物，如甲醚、乙酰化等。然后将多糖衍生物溶解在醇中，最后加入极性较小的溶剂如乙醚进行分级沉淀和分离。
2.2.2盐析法:在天然产物的水提取液中加入无机盐，使其达到一定的浓度或饱和度，从而降低有效成分在水中的溶解度，使其与其他水溶性高的杂质沉淀分离。经常盐析出来的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁和硫酸铵。
2.2.3季铵盐沉淀季铵盐及其氢氧化物是一种乳化剂，能与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。一般季铵盐及其氢氧化物不与中性多糖沉淀，但当溶液PH值升高或加入硼砂缓冲液增加糖的酸度时，也会与中性多糖沉淀。常用的季铵盐包括十六烷基三甲胺溴化物(CTAB)及其氢氧化物(CTA-OH)和十六烷基吡啶盐酸盐(CP-OH)。一般来说，在CTAB或CP-OH的浓度为1%-10% (w/v)的多糖溶液中，酸性多糖可以从中性多糖中沉淀出来，因此可以通过控制季铵盐的浓度来分离不同的酸性多糖。值得注意的是，酸性多糖混合物溶液的PH值应小于9，不能有硼砂，否则会沉淀出中性多糖。
2.2.4柱色谱法:包括纤维素柱色谱法、纤维素阴离子交换柱色谱法、凝胶柱色谱法、亲和色谱法、高压液相色谱法和其他柱色谱法。比如用活性炭和硅胶作为载体分离多糖；或者用硼砂型离子交换树脂分离中性多糖。
纤维素柱层析纤维素柱层析分离多糖兼有吸附层析和分配层析的性质。使用的洗脱剂是水和不同浓度的乙醇水溶液。从柱中流出的顺序通常是水溶性高的柱先出，水溶性差的柱最后出，这与分级沉淀法正好相反。
DEAE -纤维素(硼酸或碱型)是纤维素阴离子交换柱色谱中最常见的交换剂，洗脱剂可以是不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。这种方法是目前最常用的。一方面可以纯化多糖，另一方面也适用于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝胶柱色谱法凝胶柱色谱法可以根据分子大小和形状的不同来分离多糖。常用的凝胶有sephadex G、sepharose bio-gel A、聚丙烯酰胺凝胶p等，常用的洗脱剂有各种浓度的盐溶液和缓冲液，但其离子强度优于0.02。出柱顺序是大分子先出柱，小分子后出柱。由于糖分子与凝胶的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的体积相差很大。在多糖的分离中，多糖中的无机盐和小分子化合物通常用小孔的凝胶如Sephadex G-25和G-50去除，再用大孔的凝胶如sephadex G-200分离。凝胶柱色谱法不适于分离粘多糖。
亲和层析利用凝集素(一般是蛋白质和糖蛋白)作为亲和层析分离多糖。
高压液相色谱
2.2.5不同分子大小、形状和带负电荷的多糖在电场作用下在制备区的迁移率不同，因此不同的多糖可以通过电泳分离，电泳常用的载体是玻璃粉。具体操作是将玻璃粉用水混合成凝胶和柱，用电泳缓冲液(如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3)平衡3天，在柱上端加入多糖，接通电源，上端为正极(多糖电泳方向朝向负极)，下端为负极，单位厘米电压1.2-2 V，电流30-35 mA。电泳后，玻璃粉载体推出柱外，分别洗脱，分段后检测。这种方法分离效果好，但只适合实验室小规模使用，电泳柱内必须有冷却夹层。
2.2.6金属络合法中常用的络合剂有费宁溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅。
2.2.7其他方法:除上述方法外，还有超滤(多糖溶液可用各种已知超滤膜分离)和活性炭柱层析。另据报道，国外广泛使用的LKB柱层析系统，利用比旋度、差示折射、紫外检测多糖，自动记录各组分的峰位，分离效果好且方便。
2.3多糖纯度的鉴定
2.3.1超速离心由于颗粒在离心场中的运动速度与颗粒的密度、大小和形状有关，当多糖溶液进行密度梯度超速离心时，如果是成分均匀的多糖，应呈现单峰。具体地，将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲液配制成1%-5%的溶液，然后进行密度超速离心。转速达到一个常数(一般为60000r/min)后，通过区间照明检测是否为单峰。
2.3.2高压电泳法中性多糖因导电性差、分子量大、在电场中移动速度慢，常被制成硼酸络合物用于高压电泳。多糖的组成和分子量不同，所以多糖与硼酸形成的复合物不同，在电场作用下的相对迁移率也不同，因此可以通过高压电泳来确定多糖的纯度。通常高压电泳所用的支持物有玻璃纤维纸、真丝布、聚丙烯酰胺凝胶、醋酸纤维素膜等。缓冲溶液为0.03-0.1 mol硼砂溶液，pH为9.3-12，电压强度约为30-50 V/cm，时间为30-120 min。因为电泳会产生大量的热量，所以需要有冷却系统来维持温度在0℃左右，否则会烧坏支架。一般单糖和寡糖由于醛基的显色反应在多糖上不明显。电泳后，常用的显色剂是对茴香胺和高碘酸盐希夫试剂。
2.3.3凝胶柱层析常用的凝胶有Sephadex、Sepharose和Sephacryl。展开剂为0.02-0.02-0.2摩尔NaCl溶液或0.04摩尔吡啶和0.02摩尔乙酸1∶1，柱高与柱径之比大于40。
2.3.4旋光法在多糖水溶液中加入乙醇，使其浓度约为65438±00%，离心沉淀。向上清液中加入乙醇至浓度为20%-25%，离心得到二次沉淀，比较二次沉淀的比旋光度。如果比旋度相同，就是纯的，否则就是混合物。
2.3.5其他方法:官能团摩尔比恒定，即两次分离纯产物所得产物的- COOH、- NH2、- SO3H、- CHO等官能团摩尔比应恒定。类似的方法还有折光率法和HPLC法。此外，德国常采用高压液相色谱法检测多糖的纯度，结果可靠。
必须注意的是，纯度检查一般需要以上两种方法的结果才能确定。