分子病理学的地位和应用？
分子病理学的应用
1.伊马替尼治疗胃肠道间质瘤及c-kit和PDGFRA基因检测。
甲磺酸伊马替尼(伊马替尼，原名STI157，商品名格列卫或格列卫)是近年来成功的分子靶向治疗模型，但在GIST的基因分型治疗中仍有许多问题需要解决。深入研究GIST的分子病理机制，可以为完善其分子靶向治疗方案提供实验依据，并为其他肿瘤特异性靶点的发现提供线索。
1.伊马替尼治疗胃肠道间质瘤的分子基础
2001伊马替尼的出现，标志着针对肿瘤细胞信号转导通路的抗肿瘤策略取得了显著突破。伊马替尼是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，是基于对肿瘤细胞信号转导机制的认识而开发的第一种抗癌药物。原癌基因酪氨酸激酶与伊马替尼之间的基因型与药物的关系，为开发其他肿瘤的靶向信号转导抑制剂提供了有意义的模型[1]。最初，伊马替尼被开发为血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的特异性抑制剂。后来发现伊马替尼可以选择性抑制Bcr-Abl蛋白激酶，从而抑制白血病细胞的生长和肿瘤的形成，而不影响对正常细胞的生长和增殖起作用的激酶，对Bcr-Abl阳性的慢性髓系白血病的治疗有很好的效果。Buchdunger等人后来发现伊马替尼还能阻断酪氨酸蛋白激酶受体KIT的功能，使人联想到GIST。GIST对传统的化疗和放疗无效。临床试验已经证实伊马替尼对难治性和/或转移性GIST非常有效。目前已用于晚期不能切除的GIST，并开始作为术后复发风险高的患者的辅助治疗。我国自2001开始使用伊马替尼治疗GIST，取得了可观的疗效。
GIST是胃肠道最常见的间叶性肿瘤，美国每年至少有2000 ~ 5000例，我国发病率也在逐年上升。GIST可发生在胃肠道的任何部位，最常见于胃和小肠，少数发生在网膜和腹腔。最近的研究发现，GIST在形态学、免疫表型和超微结构上与胃肠间质Cajal细胞(ICC)相似，都具有表达KIT蛋白的特征，提示GIST可能来源于分化为ICC的干细胞。目前普遍认为GIST并不是绝对良性的，也没有发现能特异性预测恶变的指标。根据Fletcher 2000年提出的GIST生物行为分级标准，可分为极低、低、中、高侵袭风险，最终恶性判断取决于肿瘤的复发或转移。这为从分子病理学角度重新认识GIST提出了一个紧迫的任务。
原癌基因c-kit编码的KIT蛋白属于ⅲ型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(RTK)，由细胞内酪氨酸激酶区、跨膜区和具有配体结合位点的细胞外区组成。与其配体干细胞因子(SCF)结合后二聚化，激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，磷酸化受体残基，使细胞质中具有SH2功能域的信号转导蛋白与受体结合，从而激活下游信号转导通路，如Ras/Raf/MEK/MAPK通路，PLC？/DAG/IP3途径、PI-3K/AKT途径、JAK/STAT途径等。，引起一系列细胞变化，在肿瘤发生过程中调节细胞功能包括增殖、粘附、凋亡和分化[2]。因此，KIT癌蛋白的表达是GIST的核心事件，也是公认的判定GIST (CD117阳性)的特异敏感性标准。阐明KIT信号通路在临床上也具有重要意义。由于GIST患者最终可能会对KIT抑制疗法产生耐药性，人们正试图在下游信号中寻找重要的蛋白质分子作为KIT抑制疗法耐药的新靶点。
2.C-kit基因检测在伊马替尼治疗胃肠道间质瘤中的意义
1998报道GIST中存在c-KIT的基因突变，使KIT蛋白在没有配体结合的情况下仍能维持自身的酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号转导通路。目前认为kit获得性功能的这种突变是GIST的重要机制。其中编码近跨膜结构域的kit基因外显子11突变最为常见，占50% ~ 92%。此外，细胞外结构域第9外显子、激酶结构域第13外显子和磷酸转移酶结构域第17外显子的突变分别占8 ~ 13%和0 ~ 4。其中，外显子11的突变形式多样，包括框内缺失突变、点突变和框内识别串联重复ITD插入突变。国内关于GIST分子检测的报道较少，且多集中在外显子11的突变，样本量较小，突变率较低，分别为30.8%(14/52)和41.5% (34/82)，没有9和65438+。我们对60例GIST的小样本研究显示，38例(63.3%)检出kit突变，均为CD117阳性:35例(58.3%)为外显子11突变，2例(3.3%)为外显子9突变，仅为65438。在100例GIST样本中，68%检测到Kit突变(未发表)。看来我国GIST第9外显子突变率明显低于国外，因为有研究指出第9外显子属于一种特殊的突变亚型，常发生于胃外，其生物学行为具有高度侵袭性。这种(原诊断为恶性)GIST在国内的比例明显高于国外，发生在胃外的也不少见。中国人的GIST是否存在不同的基因突变位点，需要大样本研究。最近，许多研究试图将突变率与组织学特征和临床行为联系起来。早期有报道称进展期或高侵袭风险的GIST中突变较为常见，但目前多数报道认为基因突变与肿瘤大小、有丝分裂或进行性行为相关分期无明显相关性。国内相关文献是突变在高侵袭风险人群中很常见，我们的初步结果显示，即使是因其他疾病意外发现的直径小于1 cm的GIST，也有相当比例的外显子11突变，这与Antonescu CR的结果一致。因此，有必要对大样本进行统计分析，寻找我国GIST基因型与病理和临床特征之间的规律，进一步明确kit突变在GIST发生中的作用。
kit突变本身是否与患者预后有关，目前尚无定论。研究表明，kit突变是生存的独立预后指标，即有突变者的5年生存率低于无突变者。并且有研究指出，外显子11的点突变存活率高于缺失和插入突变。
伊马替尼的应用可以明显改善患者的预后。已经证实kit突变的位置可以影响GIST对伊马替尼的反应。一些体外和临床研究表明，激酶位点的突变对抑制剂无效，如与肥大细胞增生相关的激酶区域D816V的突变。幸运的是，大多数kit突变位于调控区，即非酪氨酸激酶结构域，这使得抑制剂有效地阻断了酶位点。而且与外显子11有突变者和外显子9无突变者及有突变者相比，伊马替尼部分缓解率明显提高，平均生存期延长，病情进展缓慢[4 ~ 5]。
同时，有研究认为伊马替尼可以通过促进NK细胞活性等途径发挥和增强其抗肿瘤作用。即使是KIT低表达的GIST，伊马替尼也有一定的治疗作用。
因此，检测患者手术标本中c-kit基因的突变对判断伊马替尼应用的预后具有重要意义。
3.3的检测。PDGFRA基因与胃肠道间质瘤
近年来，研究人员越来越关注GIST缺失kit突变的发生。由于发现即使在含有野生型kit的GIST中，KIT也被激活，人们将注意力转向了与KIT相关的受体酪氨酸激酶(RTK)。这类RTK包括原癌基因FMS，编码巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF1)的受体；两个PDGFR基因:包括PDGFRA和PDGFRB；FLT1是一个与FMS相关的原癌基因。其中，PDGFRA基因和kit基因位于人类4号染色体附近，其氨基酸序列具有高度同源性。最近，国外报道在28% ~ 67%的GIST中检测到PDGFRA的突变，而没有kit突变，PDGFRA和kit的突变是相互独立的。因此，认为获得功能性PDGFRA突变可能是GIST的另一个原因。一方面，PDGFRA的信号转导通路与kit相似，功能性PDGFRA突变可转化小肠Cajal细胞；另一方面，PDGFRA的功能突变可以与野生型kit结合，并在293T细胞中激活它。这一发现进一步证实了III型RTK的激活在促进GIST发生中的核心作用。国内尚无关于PDGFRA突变的报道。我们在60例中的3例(5%)中检测到PDGFRA突变，占无KIT表达病例的50%。均为外显子18(激活环域)点突变D842V，是最常见的突变形式。外显子12(近膜结构域)未检测到突变。类似于Medeiros等人的报告，这种突变在网膜/肠系膜的恶性病例中更常见。最近对Lasota J的大量案例研究表明，PDGFRA突变主要发生在胃部，大部分生物学行为是“良性的”[6]。因此，我国PDGFRA突变的突变情况需要通过扩大病例数来研究。
目前已证实PDGFRA第18外显子突变对抑制剂无明显影响，但30% PDG fra突变病例仍对伊马替尼敏感的报道提示，应重视KIT阴性GIST的诊断，检测相应基因突变，以确定是否可用于伊马替尼治疗。
因此，可以根据分子水平的变化将GIST分为至少三种类型，即kit突变体、PDGFRA突变体和非突变体。因此，GIST在大多数情况下可以被视为由单一分子机制驱动的肿瘤。然而，大多数人类癌症的发病机理是复杂的。如果我们能够根据明确的分子变化对它们进行分类，就有可能针对每种类型实施特定的基于分子的治疗。因为绝大多数的GIST都有KIT的高表达，即使在没有基因突变的情况下，也没有相关的研究是什么样的启动因素导致了这部分GIST。Kit突变是GIST的早期事件，大多数有突变的“良性”GIST并没有进展为“恶性”，说明Kit突变本身并不能引起GIST的恶性转化。导致胃肠道间质瘤恶变的因素尚不清楚。
4.C-kit基因和PDGFRA基因检测及伊马替尼治疗胃肠道间质瘤耐药。
虽然伊马替尼在治疗胃肠道间质瘤方面取得了令人鼓舞的成就，但不可避免地出现了耐药问题。初步研究表明，耐药性包括试剂盒依赖性或试剂盒非依赖性机制。大多数情况下的耐药性仍可能是由于KIT的再激活。在某些情况下，存在于药物-蛋白质相互作用位点或其附近的突变，或者可以改变蛋白质构象并降低KIT和伊马替尼之间亲和力的突变，会削弱药物的疗效。最近Chen LL等报道了5例对伊马替尼敏感的外显子9或11突变的GIST患者在用药过程中出现耐药，并获得了一个新的点突变——V654V，位于kit酪氨酸激酶结构域[7]。这种耐药性可能是由于KIT蛋白的构象变化。
有趣的是，Debiec-Rychter最近报道了一种新的机制:一名患者从kit-G565R突变通过PDGFRA次级突变D842V产生了对伊马替尼的耐药性[8]。这种现象表明，对伊马替尼的耐药性可以通过另一种激酶(如PDGFRA)的突变来实现。部分病例对伊马替尼不敏感可能与c-kit或PDGFRA基因扩增有关。因此，不提倡对GIST患者进行传统化疗，这可能会促进与疾病进化相关的克隆和分化的进展，并产生影响药物反应的基因变化。耐药性的KIT非依赖性机制是基于发现存在完全失去KIT表达的情况。间期FISH证实了标记的kit/PDGFRA基因的丢失。同时，他们还发现了几种对伊马替尼耐药的突变对PKC412敏感，PKC 412是KIT和PDGFR的另一种抑制剂。这为寻找伊马替尼耐药性的替代品提供了有意义的线索。某些病例产生耐药性的原因尚不清楚，仍有许多问题需要进一步研究。
综上所述，深入研究GIST发生、发展、有效治疗和耐药的分子机制，可以为生物靶向治疗提供依据和新靶点。
2.赫赛汀治疗乳腺癌及HER2/ neu (cerbB2)基因过表达的检测。
1的分子基础。赫赛汀在乳腺癌治疗中的应用
HER2/ neu是EGFR(表皮生长因子受体)家族的成员，在细胞信号转导中起重要作用，是细胞生长、分化和存活的重要调节因子。通常HER2/ neu只在胎儿中表达。在成年期，只有少数组织中有低表达。HER2/ neu正常基因产物的过度表达已被证明在卵巢癌、肺腺癌、原发性肾细胞癌等恶性转化中起关键作用。尤其是乳腺癌，并且是预后不良的指征。
由于HER2/ neu的过度表达与肿瘤发生密切相关，人们发现了一种针对HER2/ neu的抗体来下调其表达，命名为曲妥珠单抗(Herceptin)。它通过直接和间接机制影响肿瘤生长:直接机制是抗体与HER2/ neu结合改变受体的信号转导功能。间接机制是抗体通过ADCC和补体依赖的细胞毒作用杀死肿瘤细胞，还能诱导细胞分化和凋亡。目前已成功应用于HER2/ neu基因扩增或过表达伴或不伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者的治疗。赫赛汀无论是单独使用还是与化疗联合使用，无论是作为一线还是二线选择，都是治疗乳腺癌转移的重要选择。因其副作用小，患者耐受性好，已成为靶向治疗的成功范例。
2.her 2/neu基因过表达的检测方法
如何准确、便捷地检测HER2/ neu基因过度表达的乳腺癌病例，为赫赛汀的治疗提供依据，判断预后，成为病理学家不断研究的课题。
目前，最常用的方法是ELISA、FISH(原位杂交免疫荧光)和IHC(免疫组织化学)。ELISA主要用于检测乳腺癌患者血清或新鲜组织中的总蛋白p185。该方法灵敏、简单、安全、成本低，但仅适用于新鲜标本，不适用于石蜡包埋组织。FISH法用于检查有丝分裂细胞的核型，鉴定染色体数目，确定肿瘤细胞来源。该方法特异性强、稳定、灵敏，可直接观察HER2/ neu基因的扩增情况。主要缺点是价格昂贵，难以普及。IHC法因其操作简单而被广泛使用。但假阴性率高，主观因素对阳性信号程度的解释影响较大。我们正在尝试通过实时PCR(实时监控聚合酶链反应)检测HER2/ neu基因的过度表达。这种方法是在分析mRNA扩增水平的基础上，实时检测PCR扩增产物，不需要进行一般的PCR产物处理，从而避免了操作带来的各种问题[9]。可以动态监控整个PCR过程，定量实用。特别强调，只有将上述检测方法统一、规范，才能提供准确的HER2/ neu基因状态，为治疗提供可靠依据。
3.其他人
除了上述两种成功的药物，还有许多分子靶向药物也显示出良好的应用前景。例如，一些肺癌病例在EGFR抑制剂的治疗下是有效的，这与EGFR激酶结构域的突变有关。最近，抑制肿瘤介导的血管生成为肿瘤治疗提供了一种新的非细胞毒性途径。阿瓦斯丁(Bevacizumab，rhumab-VEGF)是第一个人重组抗VEGF单克隆抗体，能结合并阻断VEGF(血管内皮生长因子)的作用，从而发挥抗肿瘤活性。其疗效不仅与间质血管的形成方式有关，还与肿瘤中VEGF的表达水平有关[10]。
可以预期，未来分子病理学将在肿瘤分子靶向治疗的研究和应用中发挥更大的作用，同时也将促进其与临床紧密结合，更加实用。