高通药物筛选简介
化合物样品的来源主要有两种:人工合成和从天然产物中分离纯化。其中，人工合成可通过常规化学合成和组合化学合成进行。
2.自动化操作系统
自动操作系统使用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件用物理图像表示实验设备，简单明了的图表表示机器的动作。自动操作系统的工作能力取决于系统的组成，可以根据需要配置加样、洗涤、热解、离心等设备进行相应的工作。
3.高灵敏度检测系统
检测系统一般采用液体闪烁计数器、化学发光检测计数器、宽带分光光度计、荧光光度计等。
4.数据库管理系统
数据库管理系统承担四个功能:样本库的管理功能；生物活动信息的管理功能；高通药物筛查的服务功能；药物设计和药物发现功能。常用的筛选模型是在分子水平和细胞水平，观察药物与分子靶点的相互作用，可以直接了解药物作用的基本机制。
1.分子水平的药物筛选模型:受体筛选模型；酶筛选模型；离子通道筛选模型
1.1受体筛选模型:指受体与放射性配体的结合模型。针对受体的筛选方法包括检测功能反应、第二信使产生以及标记配体和受体之间的相互作用。
1.2酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特性，可以将酶的反应底物和产物作为检测指标，并据此确定反应速度。典型的酶筛选包括在合适的缓冲液中孵育；(2)控制反应速度，如温度、缓冲溶液的pH值和酶浓度；(3)单次计数器，需要测量产品的增加和底物的减少。
1.3离子通道筛选模型:(1)贝类毒素的高通筛选，其靶标是文蛤毒素在Na+通道上的结合位点，与放射性配体进行竞争性结合试验，考察被测样品。(2)酵母双杂交法高通筛选干扰N型钙通道β3亚基与α 65438+β亚基相互作用的小分子，寻找新的钙通道拮抗剂。
2.细胞水平药物筛选模型
观察筛选的样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体方式和靶点，只能反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括内皮细胞活化；凋亡；抗肿瘤活性；转录调控检测；信号转导途径；细菌蛋白质分泌；细菌生长。
与传统的药物筛选方法相比，高通质谱筛选技术具有以下优点:反应体积小；自动化；灵敏快速的检测；非常具体。然而，作为药物筛选的一种方法，高通群体筛选并不是一种通用的方法。首先，高通质量筛选主要采用分子和细胞水平的体外实验模型，任何模型都不能全面反映药物的综合药理作用；其次，用于高通筛查的模型是有限的且不断发展的，建立一个反映身体所有生理功能的理想模型是不现实的。但我们应该相信，随着高通筛选研究的深入，随着筛选模型的评价标准、新药靶点的发现以及筛选模型新颖性和实用性的统一，高通筛选技术将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。光学测量技术。在高通筛选试验中，美国和英国的研究人员努力研究光学测定方法，建立了大量的非同位素标记方法，如用分光光度法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂和组织纤溶酶原激活剂，均获得成功。
放射性检测技术。美国学者GanieSM将放射性测量方法，尤其是亲和闪烁(SPA)检测方法应用于高通药物的筛选研究，在96孔板中开展了样本量实验。该方法具有较高的灵敏度和特异性，促进了高通剂量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。
荧光检测技术。根据美国学者GiulianokA的研究，Flipr (Fluorometric Readet)荧光检测法可以在短时间内同时测量荧光的强度和变化，是测量细胞内钙离子电流、细胞内pH和细胞内钠离子电流的理想高效的检测方法。
多功能微孔板检测系统。Xi交通大学药学院研发的1536多功能高通量微孔板检测系统是国际先进的高通量检测系统，可进一步提高筛查能力，已在该院投入使用。
1.基本原则
高通药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新技术体系。它以分子和细胞实验方法为基础，以微孔板为实验工具载体，自动化操作系统进行实验过程，灵敏快速的检测仪器收集实验数据，计算机对实验数据进行分析处理。它的正常发展需要大容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效的数据处理系统和高度特异的药物筛选模型。
1.1化合物样品库
高通筛选是使用现有化合物的体外随机筛选。因此，通过高通量药物筛选发现先导化合物的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量和质量。复合样本的数量是指不同样本的数量。化合物样品的质量主要取决于化合物结构的多样性。许多反应基团增加了初始筛选中的假阳性数量，消除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。
化合物样品的来源主要有两种:人工合成和从天然产物中分离纯化。
人工合成可分为常规化学合成和组合化学合成。常规化学合成的纯化合物一直是国外制药公司建立化合物样品库的主要来源。他们通过多年积累的化合物建立化合物样本库，通过购买和化合物交换，大大提高化合物样本库的数量和质量。
组合化学的出现为化合物数量的大量增加提供了另一个来源。组合化学的基本原理是通过适当的化学方法，在特定的分子母核上加入不同的基团，在相同的条件下产生大量的新化合物。这种方法在化合物的结构修饰和优化方面显示出强大的优势。但由于这种方法是基于母核结构的改造，产生的大量化合物在结构多样性上仍有很大的缺点。解决组合化学产品的结构多样性问题已成为化学研究者的研究课题。
从天然产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团都是经过长期自然选择形成的，通过高通筛选得到的生物活性在药物发现中具有合成化合物不可比拟的优势。因此，增加样品库中具有结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的重要途径。为了提高高通筛查的阳性率，跨国制药公司已经或正在寻求帮助在中国购买天然产物单体。
1.2自动操作系统
高通药物筛选每天需要检测上千个样本，枯燥且步骤单一，人工操作容易疲劳出错。自动化操作系统使用微孔板作为反应容器，并具有固定的分配格式。不同的微孔板都有条形码标记。自动操作系统通过光电阅读器对特定微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果和相关数据存储在计算机中，使得筛选结果准确，实验过程快速。
自动操作系统的编程过程简洁，易于操作。自动操作系统的工作能力取决于系统的组成，可以根据需要配置加样、洗涤、裂解、离心等设备进行相应的工作。
除了实验步骤的需要，自动采样方法是决定筛选速度的重要因素。主要有单孔、8孔、96孔、384孔。单孔一般用于复筛中对照样品和分散样品的转移。96孔和384孔对于需要同时开始和停止反应的酶活性检测和筛选模型是必需的。
自动化操作系统的一个重要部分是酒店。所谓堆，是指放置样品板和反应板，并在操作过程中进行转移所需要的空间。因此，高通筛选的样本数量取决于堆栈的容量。
可以看出，高通药物筛选自动操作系统由计算机及其操作软件、自动加样设备、孵育离心设备、堆栈四部分组成。不同的单位可以根据主筛选模型类型和筛选规模购买不同的部件，集成为一个完整的操作系统。
1.3检测系统
快速高灵敏的检测技术是筛选高通类药物的关键技术之一。随着检测仪器灵敏度的不断提高，即使对于痕量样品的检测，也能获得良好的检测结果。
1.3.1液体闪烁计数放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪和基因分析。由于采用了双光电倍增管和时间分辨耦合电路技术，有效降低了背景信号的干扰，提高了测定灵敏度，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可以控制在10cpm左右。
亲和闪烁分析是一种新的液体闪烁分析方法。该方法广泛应用于细胞表面受体药物筛选。当高通质量筛选用于确定细胞表面受体的亲和结合时，放射性配体标记过滤分析技术已经被亲和闪烁分析所取代，因为它需要被分离。亲和闪烁分析技术通过亲和结合将放射性配体与带有受体的闪烁球结合，从而产生光子，减少了放射性配体标记分析中游离配体与结合配体的分离过程，使放射性配体分析完全自动化，适用于高通筛查。产生低能放射性粒子的同位素可以用于放射性标记，这种低能放射性粒子可以在短距离内被重吸收，以确保只能检测到与受体表面结合的配体。SPA技术广泛应用于激酶、核酸加工酶的分析以及受体配体的相互作用分析。
1.3.2分光光度计为了适应高通量药物的筛选，很多公司都生产了可以同时检测多孔板的带计算机接口的分光光度计。以分子器件公司的spectra 190为例，它使用8根光纤同时测量8个孔。测量波长相隔2纳米，可在190纳米至850纳米之间选择。对于未知物质，可以在这个范围内进行扫描，确定其特征吸收光谱。因此，造型的多样性大大增加。测试数据以不同的文件格式输出，可由随机软件或通用数据处理软件处理。方便、快捷、准确、自动化程度高。随着高灵敏分光光度仪与自动操作系统的连接，基于紫外可见光谱的高通药物筛选模型已成为主要的模型类别。
1.3.3化学发光检测化学发光是指在酶的作用下，显色物质的化学能以光子的形式释放出来。根据发光的形式和类型，化学发光可分为发光型和闪光型。发光化学发光，如基于AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等发光反应。其发光时间长且稳定。而以发光蛋白、ATP、荧光素酶为底物的发光反应是闪光发光反应，发光时间短。由于使用了时间分辨和耦合环技术，背景去除更加有效，化学发光的检测灵敏度达到0.1pg。在单孔多点喷射技术中，用于检测化学发光的光纤末端有一个用于加入反应底物的喷嘴。反应性基质从100个小孔中喷出，使反应性基质加入孔中后能混合均匀。同时发光反应开始后，可立即测定，更有利于闪光化学发光的测定。
1.3.4激发荧光检测新型激发荧光检测器在传统仪器的基础上用连续激发光谐波测量光谱代替固定光谱，使模型更加灵活。荧光检测法之所以灵敏，是因为大多数荧光基团的半衰期都很短，即使用微弱的激发光源就可以获得大量的光子流。这一特性和多种可用的荧光模式使得荧光检测技术成为高通筛查的必要应用手段。荧光技术广泛应用于均相筛选分析。其中包括荧光振动能量转移(FRET)、荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRET)和荧光相关光谱(FCS)。
1.4数据库管理系统
高通药物筛选的特点是通过多模型筛选数万个化合物样本。适应高通药物筛选的数据库管理系统主要承担四个功能。
样品库管理功能:化合物样品库存储和管理用于高通量药物筛选的化合物样品的各种物理和化学性质。分析每个新化合物的新颖性，排除结构相似的化合物，避免不必要的筛选。由于高反应性基团增加了假阳性的可能性，样本库对新储存的化合物进行反应性基因检测，以去除此类化合物。
生物活性信息管理功能:生物活性清单存储每种化合物经不同模型测试的结果，根据多个模型的测试结果综合评价该化合物的生物活性。
高通定量药物筛选的服务功能:高通定量药物筛选工作量大，自动化程度高，也涉及到很多繁琐的工作。高通定量药物筛选数据库管理系统管理与药物筛选相关的业务沟通、档案管理和各种样本标签的打印，使高通定量药物筛选的各个环节程序化、规范化。
药物设计和药物发现功能:基于高通的药物筛选产生了大量化合物的结构信息，随着筛选，生物活性信息也大大提高。高通定量药物筛选数据库管理系统通过分析同一模型中不同阳性化合物的结构，找出构效关系，从而为药物设计提供参考。
1.5筛选模型
指用于检测药物作用的实验方法。因为高通筛查需要的总反应体积小，反应的特异性和敏感性高，所以也需要更高的筛查模型。这些模型主要关注受体、酶、通道和各种细胞反应。基因水平的药物筛选模型使得药物筛选模型的范围更广。
1.5.1以酶为靶标的高通筛选大多数以酶为靶标的高通筛选方法都是直接检测酶的活性。具体方法根据酶的不同而不同，主要包括基于放射性的方法和基于比色法和荧光法的方法。
大多数基于放射性的方法是标记底物并确定放射性产物的产生。Taft等人建立了(1，3)β-葡聚糖酶抑制剂(抗真菌药)的高通筛选方法。将含有酶、α-淀粉酶和UDP-14C-葡萄糖的菌丝体提取物加入96孔板的孔中，孵育并反应。反应终止后，滤出未合成的底物。闪烁计数用于检测保留在过滤器上的(1，3)β-葡聚糖，表明酶的活性。
也有标记酶和确定特异性结合酶的方法。Vollmer等人建立了一种针对多溴联苯醚(PBP)的抗生素高通筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽基转移酶，该方法用于筛选其糖基转移酶结构域活性位点上的缀合物。将单霉素与小球混合制成悬浮液，加入96孔板中。然后，加入3H标记的PBP(细菌膜的粗提物)和测试化合物，孵育并过滤以除去未结合的放射性。通过闪烁计数测量的放射性表明PBP和单霉素的结合以及测试化合物对其的影响。
此外，基于放射性而无需过滤和分离的SPA也有应用。Brown等人建立了一种检测内源性肽酶水解活性的方法来研究其抑制剂。用3H标记的肽底物通过生物素连接到包裹有抗生物素蛋白的SPA闪烁球上。酶水解使3H随着肽的裂解而离开闪烁球。测量3H放射性作用在闪烁球上产生的闪烁信号的损失，表明酶的活性。
有一些关于基于比色法和荧光法的方法的报道。Waslidge等人建立了脂肪氧合酶抑制剂的筛选方法。在酸性条件下，脂质过氧化物可将Fe2+氧化为Fe3+，进而氧化二甲酚橙。该产品在620nm的可见光区有很强的吸收。96孔板测定。张等建立了HIV逆转录酶抑制剂(抗病毒药物)的筛选方法。方法采用均相时间分辨荧光(HTRF)技术，不仅实现了无分离操作(均相)，而且避免了放射性同位素的使用。这种方法是基于逆转录酶可以很容易地将核苷酸类似物(如生物素-11-dUTP)引入新的DNA链。在96或384孔板中，将生物素化的引物/模板和链霉亲和素-铕混合并在孔板中孵育，加入逆转录酶，然后加入生物素-dUTP和d-TTP的混合物以开始反应。反应60分钟后，加入链霉亲和素-别藻蓝蛋白，孵育，用HTRF分析仪读取数据。该方法也可用于许多其他核酸聚合酶。
1.5.2以受体为靶点的高通筛查和以受体为靶点的高通筛查法。检测功能反应的优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典功能检测方法的通量较低，而基于重组技术的报告基因检测方法的引入大大提高了筛选通量，既高效又节约成本。传统的检测第二信使或下游机制(如磷酸化)的方法也很麻烦，不适合高通量检测，但将这些机制与报告基因偶联可以克服这些问题。
1.5.3高通筛选靶向离子通道Negri等人建立了贝类毒素的高通筛选方法。它的靶标是文蛤毒素(STX)在Na+通道上的结合位点，利用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验，考察被测样品。Yong等利用酵母双杂交方法，通过高通量筛选干扰N型钙通道β3亚基与α 65438+β亚基相互作用的小分子，寻找新的钙通道拮抗剂。
1.5.4以核酸为靶标的高通筛选Hamasaki等人建立了以16S rRNA编码区结构和HIV-RRE RNA结构为靶标的抑制剂高通筛选方法。寻找与氨基糖苷类抗生素相似但亲和力更高或作用于同一核酸其他位点的新化合物，以及不易被代谢灭活的新化合物。方法基于含芘的氨基糖苷类似物与RNA结合时芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板中，将芘羰基巴洛霉素(PCP)和RNA结构混合成溶液，然后加入到具有测试化合物的板的孔中，用荧光读取器研究荧光恢复的程度。
1.5.5基于细胞功能的高通筛查
1.5.5.1激活内皮细胞是急慢性炎症过程中的重要环节。Rice等人以细胞表面E-选择素的表达为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培养体系。在IL-1的刺激下，用ELISA定量内皮细胞表面E-选择素的表达。该方法包括细胞固定、加入液体、加入受试化合物等操作，可保持细胞完整、廉价、可重复，筛选速度可达每周1000个化合物。适用化合物范围很广，该方法以细胞为检测对象，可以更早发现细胞对化合物的摄取和化合物的细胞毒性。
1.5.5.2细胞凋亡Erusalimsky等人建立了一种新的细胞凋亡调节因子高通筛选方法。细胞预先用3H胸苷标记，与凋亡诱导剂孵育，连续通过两种玻璃滤器。一种是中性的，捕捉完整的染色质和高分子量DNA。另一个包含DEAE活性基团以捕获低分子量DNA片段。通过测量过滤器上的放射性，可以量化DNA的断裂。
1.5.5.3抗肿瘤活性陆等建立了利用“生物活性指纹图谱”筛选抗肺癌药物的方法，考察了受试分子(类维生素A和类维生素A相关分子)对多种不同细胞系的作用特征。检测指标包括:(1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括大量不同的组织和/或肿瘤来源。在细胞暴露于测试化合物5天后，通过标准比色法测定存活细胞的百分比。20%的生长抑制率表示活性。(2)集落形成抑制试验，以区分细胞生长抑制和细胞杀伤。将NCI-H292非小细胞肺癌细胞加入到6孔板中，并暴露于测试物质一段时间。然后，将细胞洗涤并种植在没有测试对象的培养基中7天。细胞用结晶紫染色以研究集落形成。(3)凋亡检测:ELISA法检测细胞DNA片段化。(4)转录调控检测，用于考察受试化合物是否存在视黄酸受体介导的转录抑制。该方法是用73Col-CAT报告基因及其受体的表达载体转染HeLa TK-细胞，与受试物一起培养。ELISA法检测CAT活性。
1.5.5.4 G2关卡)Roberge等人建立了G2关卡抑制剂的高通筛选方法。培养MCF-7m p53细胞并种植在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射后，细胞进入G2静止期，通过ELISA检测磷酸化形式的核仁素，从而获得从G2释放到M期的细胞数，即G2关卡抑制的程度。
1.5.5.5信号转导通路苏等建立了TGFβ3通路的筛选方法。融合报告基因的构建、细胞转染和可被TGFβ诱导荧光素酶表达的克隆的筛选。将细胞种植在96孔板中，与测试化合物一起温育，稀释并加入稳态Glo底物以测量荧光素酶活性，并与对照比较，计算相对酶活性的增加值。
1.5.5.6细菌蛋白质分泌Alksne等建立了具有抑制细菌蛋白质分泌功能的新抗生素的高通筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调节的翻译蛋白。当细菌蛋白质的分泌受到干扰时，报告基因被诱导。
1.5.5.7细菌生长Chung等建立了抑制分枝杆菌生长的化合物的高通筛选方法。腐生分枝杆菌被选择来代替结核分枝杆菌，因为其快速生长和非感染性特征。通过测量细胞对放射性标记的尿嘧啶的摄取来研究测试化合物对分枝杆菌活性的影响。以96孔板的形式，在1d内可以检测上千个样本。
2.生药活性成分的高通筛选。
样品是高通定量药物筛选的物质基础，样品库来源的化学多样性是决定高通定量筛选技术成功的关键因素之一。如前所述，化合物样品主要来自常规化学合成、组合化学合成和从天然产物中分离纯化。而从天然产物中分离出来的化合物，由于其母核结构和活性基团是经过长期自然选择形成的，因此具有合成化合物无法比拟的优势。
中国有丰富的药用资源。几十年来，我们用药理手段对中药进行了大规模的研究和筛选，取得了很大的成就。而仅依靠传统的药理学实验方法，耗时耗力，需要大量的实验动物，显然不能适应大量样本的同时筛选。虽然通过努力从生药中分离、提取、纯化出了大量的化合物，但由于研究方法的落后，大量分离出来的化合物不能被充分利用，造成了化合物资源的极大浪费。
因此，将高通定量筛选技术应用于生药有效成分的研究，不仅是对高通定量筛选技术的不断完善，也是将该技术应用于中药现代化的有益尝试。
如何用高通量筛选生药的活性成分？其原理和方法与合成化合物的高通筛选基本一致，主要区别在于化合物需要从生药中提取，并在筛选前进行适当的分离和化学多样性评价。同样的我就不赘述了，这里主要说说提取、分离、多样性评价的问题。
2.1提取由于高通筛查需要大量的样本来源，常规的提取方法显然无法满足这一要求。迫切需要找到一种快速、高效、连续、自动化的提取方法。加速溶剂萃取技术是一种新型的萃取技术。样品制备完成，设定提取方法(或程序)后，自动采样自动采集装置可自动提取样品，连续采集多达24种不同样品的提取液，简单方便。通过使用该技术，可以获得大量的生药提取物。
2.2化学多样性的分离与评价众所周知，生药的化学成分相当复杂，提取得到的提取物往往是大量单体的混合物，因此在筛选前需要对生药的提取物进行适当的分离。在众多的分离方法中，制备型高效液相色谱是最理想的，它具有快速、高效、自动化等优点。
在分离之后，有必要评估被分离物质的化学多样性，以提高高通筛选的效率。过去，这种评价大多基于地理分布、生物分类、化学分类和来源之间的关系。随着科学技术的进步，许多现代方法开始应用于化学多样性的评价。其中，色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)技术在这方面做了有力的尝试。首先，制定组分的离子信号(m/z)与保留时间的关系图，然后评估这些数据的统计相似性，以定量评估样品的多样性。然后将三维HPLC数据转换成CDF文件格式，传输到UNIX工作站。数据文件中的每个离子(包括保留时间、质量数、离子强度等数据)都位于二维图中，保留时间和质量数共用一个轴，离子强度数据存储在站点中。滤除噪声后，计算离子的中心时间和中心质量。根据LCMS的数据处理，定量计算混合物之间的相似性。该数据处理基于以下关系，其代表样品1中的离子I和样品2中的离子J之间的“化学空间”距离。
其中ti代表离子I的色谱保留时间，mi代表离子I的质荷比(m/z)，wt是保留时间的权重系数，wm是质量的权重系数。Dij是离子I和离子J之间的欧几里德距离，n1和n2分别是样品1和样品2中确认的离子数。Sij是离子I和离子J的相似度(0-1)。相似性值1表示相同的样本。相反，相似性值接近0表明样品具有高的化学多样性。该方法可以很好地解决样品化学多样性的评价问题。