抗氧化剂与耐缺氧的关系
关键词:缺氧；中药合剂；抗氧化剂；谷胱甘肽过氧化物酶；过氧化氢酶
中药合剂对缺氧大鼠脑的抗氧化保护作用
乔峰、蒋、*、李霞、、潘、建、元
(南通大学，江苏省226001，中国；南京医科大学附属淮安医院，淮安223000。上海交通大学海洋工程科学研究所，上海200231，中国)
目的观察中药合剂对大鼠脑缺氧的影响。方法在低压舱中建立缺氧状态。研究了中药合剂对缺氧和常氧状态下大鼠脑组织中谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的影响。在另一个实验中，用茜素紫分光光度法在体外测定上述混合物的羟自由基清除活性。结果低氧组GSH含量和GSHPX、CAT活性均显著下降，但中药合剂预处理组GSH和GSHPX下降幅度较小。在常氧状态下，中药合剂使GSH和GSH-PX升高。此外，在体外H2O2/ Co2+实验体系中，中药合剂对羟自由基的清除作用呈剂量依赖性。结论本研究结果提示中药合剂对缺氧大鼠脑具有抗氧化神经保护作用，其机制可能与提高抗氧化酶GSHPX活性和GSH含量，以及直接清除自由基有关。
关键词缺氧；中草药混合物；抗氧化；GSH-PX；加泰罗尼亚语
近年来，实验研究表明，神经保护是防治缺氧性脑损伤的有效措施，尤其是抗氧化药物的开发和应用已成为防治神经元损伤的热点之一。国内外研发的许多西药神经保护剂都有一定的毒副作用，因此临床应用受到限制[1]。我国对中药抗缺氧作用的研究表明，中药具有作用温和、保护作用一致、神经细胞损伤多样的特点，但目前研究仅限于单一药物，复方制剂的抗氧化和自由基清除能力报道较少。对丹参、当归、党参、黄芪等中药的研究表明，它们都具有提高耐缺氧能力、清除氧自由基、降低血液粘度、改善微循环等多种功能[2，3]。利用已建立的低压缺氧模型，观察上述药物组成的混合物对缺氧性脑损伤的抗氧化保护作用及其体内外抗自由基能力，并分析其可能机制，为临床应用提供实验依据。
1材料和方法
SD大鼠40只，材料为1.1，其中24只由南通大学实验动物中心提供，体重(240±20)g，分为常氧组(5只雄性，4只雌性)、低氧组(8只雄性，半只雌性)和中药合剂组(4只雄性，3只雌性)。65，438±06只动物，体重(230±20)g，购自上海复旦大学实验动物科学系。分为对照组和中药合剂组，每组8只，雌雄各半。中药合剂由上海交通大学海洋水下工程科学研究所提供。主要成分为丹参、当归、党参、黄芪，生药含量为0.4 g/ml。GSH、GSHPX和CAT试剂盒购自南京程健生物工程研究所。茜素紫(C20H12O7)由Chroma公司生产，上海化学试剂站分装厂分装。其他试剂均为国产AR级。
1.2方法
1.2.1的给药方法实验前(缺氧)48、24、1 h对所有中药合剂组进行腹腔注射(i.p .)，剂量为1 ml/200 g？wt .另两组注射等量的生理盐水。
1.2.2缺氧暴露:将中药合剂组和缺氧组动物置于低压舱(舱容为0.01 m3)，关闭舱门，调节舱压，在1 h内分三个阶段将压力降至相当于海拔8 040 m的气压(0 ~ 3 130 ~ 6 080 ~ 8。中间两阶段分别停留在10和15 min，保持8 040 m压力5 h，然后加压出舱10 min。常氧组作为实验对照，在常压下在舱侧停留6 h。
1.2.3样品制备中药合剂组和缺氧组在出舱后与常氧组动物一起快速断头。取左侧脑组织，在0 ~ 4℃冷生理盐水中冲洗，去除血液，用滤纸擦干，称重(约100 ~ 130 mg)，加入9倍的0 ~ 4℃生理盐水。对照组和中药合剂组动物脑匀浆的制备在末次给药后65±48小时进行。
1.3检测指标GSH、GSHPX、CAT的测定均按试剂盒说明书分步进行。福林酚法测定脑匀浆中蛋白质含量。采用改良的茜素紫分光光度法检测H2O2/Co2+体系产生的羟自由基，测定中药合剂对羟自由基的清除率[4]。在测定过程中，根据参考文献[5]中每种药物的浓度制备三个平行样品，并计算平均值。
1.4处理的脑匀浆中GSH、GSHPX、CAT的结果用(s)表示，数据用Stata6.0统计软件进行统计处理，用单因素方差分析和Scheffe法进行比较。羟自由基清除率数据用非线性回归的四参数Logistic标准曲线模拟，EC50按下式计算:y = min+(max-min)/(1+(x/EC50)hill slope)。
2个结果
2.1中药合剂对缺氧处理后脑匀浆中GSH、GSH-PX、CAT的影响见表1。
表1中药合剂对缺氧处理后大鼠脑组织GSH、GSH-PX和CAT的影响(略)
与常氧组相比，δP < 0.01；与缺氧组相比，* P < 0.05#P<0.01
表1表明，缺氧暴露后，大鼠脑中GSH含量、GSH-PX和CAT活性明显降低(P < 0.05438+0)。中药混合物预先使用后再暴露于缺氧环境，三项指标均上升。与缺氧组相比，GSH和GSH-PX的变化有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，但与常氧组相比仍明显下降(P < 0.01)。结果表明，该中药合剂具有一定的抗氧化和神经保护作用。
2.2中药合剂对常氧状态下脑匀浆中GSH、GSH-PX和CAT的影响见表2。
表2中药合剂对常氧状态下脑组织中GSH、GSH-PX和CAT的影响(略)
与生理盐水组相比，* P < 0.05，* * P < 0.01；n=8
表2显示，与生理盐水组相比，中药合剂组GSH、GSH-PX、CAT均升高，仅GSH、GSH-PX变化有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。说明在常氧条件下，中药合剂能提高脑组织的GSH水平和GSH-PX活性，增强脑组织的抗氧化能力。
2.3中药合剂体外抗羟自由基作用见图1。如图1所示，中药合剂体外清除率与药物浓度之间存在明显的量效关系，即浓度越大清除效果越好，但达到一定浓度后趋于饱和。根据计算，中药合剂的浓度(EC50)为0.07 ml/10 ml，相当于2.8 mg/ml。
图1羟自由基清除率与药物浓度的量效关系(略)
3讨论
研究表明，缺氧性脑损伤是一个复杂的病理生理过程，涉及神经递质系统功能障碍、细胞内钙超载、神经毒性以及一氧化氮和自由基的炎症损伤等多种机制。自由基的急剧增加是缺氧的重要病理生理基础[6]。正常情况下，人体内的自由基是不断产生和清除的。大脑缺氧时，体内氧化-氧化系统失衡，形成恶性循环，导致体内自由基堆积。自由基清除和抗氧化制剂可分为酶自由基清除剂和非酶自由基清除剂。酶促自由基清除剂主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)。本文研究结果表明，缺氧导致脑组织匀浆中GSH-PX、CAT活性和GSH含量降低，表明脑组织抗氧化系统的抗氧化能力降低，而中药合剂能明显减轻缺氧时GSH含量和GSH-PX活性的降低，提高脑组织的抗氧化能力，有助于减轻脑缺氧损伤。通过进一步的实验，我们发现中药合剂在正常情况下也能提高脑组织中GSH-PX活性和GSH含量。此外，体外抗羟自由基实验表明，该中药合剂对羟自由基也有直接清除作用，且有剂量依赖关系。这些结果表明，如果将中药混合物用于脑缺氧，具有抗缺氧的神经保护作用，这可能与配方中的药物提高了体内抗氧化酶的活性和自身对氧自由基的清除作用有关。谷胱甘肽具有重要的生理功能。可通过GSH-PX减少体内不断产生的脂质过氧化物和过氧化氢，以消除其对酶和膜蛋白上巯基的氧化作用，维持细胞和组织的正常功能和代谢[7]。反应中生成的GSSG可被GSH还原酶催化，磷酸戊糖旁路生成的还原型辅酶ⅱ(NADPH)在缺氧时可被还原回GSH。由于过氧化物生成速率大大超过细胞内NADPH生成速率，GSH/GSSG比值降低，GSH-PX活性降低，导致氧化应激。GSH-PX是大脑中含量较高的含硒酶，在与超氧化物歧化酶(SOD)共处理自由基的过程中起主要作用。可以清除线粒体和细胞质中产生的H2O2，从而预防。哦)。羟基自由基在化学性质上非常活跃，被认为是对生物体危害最大的自由基[9]。它具有与自由基清除剂和组织反应的强能力，因此非常高浓度的自由基清除剂可以是有效的。事实上，当自由基清除剂浓度很高时，往往会产生明显的副作用，限制了很多药物的应用[10]，而中药优势很大，作用温和，环节多，相互之间可能存在协同作用。综上所述，在本实验条件下，中药合剂对大鼠缺氧脑组织具有一定的抗氧化神经保护作用，这与药物提高机体自身抗氧化能力及其对自由基的直接清除作用有关。本研究为该中药合剂在抗缺氧性脑损伤中的应用提供了重要参考。
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基金项目:江苏省高校自然科学基金2003年度资助项目(03KJD310185)。
(南通大学，江苏南通226001；南京医科大学附属淮安第一医院，江苏淮安223000；上海交通大学海洋水下工程研究所，上海200231)