药物分析:中药制剂的薄层扫描法

薄层扫描法是用一定波长的光照射薄层板,扫描具有紫外和可见光吸收或激发后能发出荧光的斑点,利用扫描图谱和积分数据进行药物鉴别、检验和含量测定的方法。薄层扫描法具有分离效率高、快速、简便的特点,适用于中药分析。薄层扫描法虽然精密度不如高效液相色谱法高,但对于没有紫外吸收或不能用高效液相色谱分析的成分,如人参皂苷、贝母生物碱等,可以作为补充。

测试条件的选择

薄层色谱条件:原则上成分要完全分离,斑点要对称、均匀、不拖尾。

(2)检测方法:吸收法和荧光法。在可见光和紫外区有吸收的成分可以通过在200~800nm范围内的吸收测量来确定。对于具有荧光的组分,可以选择激发波长(λex)和发射波长(λem)。荧光法具有特异性强、灵敏度高、线性范围宽的特点。

(3)测量方法:有反射法和透射法两种方法。反射法是将光束照射在细光斑上,测量反射光的强度;反射光灵敏度很低,

受薄层厚度影响小,基线稳定,信噪比高,所以用得多。透射法受薄层厚度影响较大,玻璃吸收紫外光,实际中很少使用。

(4)扫描方式:有单波长和双波长两种。双波长是两束不同波长的光,一束测量样品称为测量波长(λs);另一束作为对照,称为参考波长(λR)。两束光通过斩波器交替照射在斑点上,用吸光度之差δA量化。双波长可以消除薄层不均匀的影响,使基线稳定。通常,测定波长是测定组分的吸收波长,并且可以在组分没有吸收的位置选择参考波长。如果背景光谱在与λS相同的吸收处,就可以达到消除背景干扰的目的。单波长法通常由散斑吸收光谱确定。

还有线性扫描和锯齿扫描:线性扫描是单向扫描,光束略长于斑点,速度快,但斑点形状不规则或浓度不均匀时误差较大,主要用于荧光测定;锯齿扫描使用微小的光束同时在两个相互垂直的方向上扫描。由于光束较小(1.25mm*1.25mm),光束内部的浓度差可以忽略,所以受光斑形状和浓度分布的影响较小。【医学教育网收集整理】

(5)散射参数SX:由于薄层散射光,其吸收a和浓度KX不服从比尔定律,而是符合K-M方程,其吸收因散射而减小。A-KX的曲线偏离横轴,不是一条直线,其形状与SX有关。为了方便确定。薄层扫描仪配有线性化器,用于校正工作曲线,使其成为直线。因此,在测定中需要输入散射参数SX的值。许多薄层板的SX值是已知的。如果未知,可以根据修正结果判断(图)。

测定方法的选择

外标法:如果标准曲线经过原点,可用一点法校正;如果不经过原点,必要时采用两点法和多点修正法进行修正。测定时,供试品溶液和对照品溶液应在同一薄板上交叉,供试品不少于4个,对照品每个浓度不少于2个。

内标法:内标法是将内标加入供试品溶液和对照品溶液中,以其峰面积之比作为定量依据。目前很少使用。

影响注意事项的因素很多,测量时应注意以下几点:薄层厚度要均匀,表面要平整,使用预制板材;取样要准确,产地大小要一致;显影剂要喷洒均匀,用量适中;并用胶带固定。

该方法的线性范围较窄,应在其线性范围内测定。

《中国药典》(95版)共有17种药材及制剂,含量测定采用此法。

示例脑得生丸中人参皂苷的含量测定。

准确称取供试品2g,置于索氏提取器中除去脂溶性杂质,然后用甲醇连续回流提取人参皂苷,挥发甲醇,残渣加水溶解,用正丁醇萃取纯化,减压回收正丁醇,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液;另取人参皂苷Rg1作为对照品,加入甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液作为对照品溶液。吸取供试品溶液2~4μl,分别与对照品溶液2μl点于高效硅胶G薄层板上,以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)5 ~ 10℃为展开剂。喷10%硫酸乙醇溶液,于110℃加热至专色清晰,取出,于薄层板上盖一相同大小的玻璃板,用胶带固定,照薄层扫描法测定,波长:λS = 525nm,λR = 700nm,测定供试品和对照品的吸光度积分值,计算。【医学教育网收集整理】

该方法采用两点校正法,标准曲线可以用计算器进行线性回归处理或用以下公式计算,因为m = a Ba,b = (m1-m2)/(A1-A2),a = m1-bA1。

高效液相色谱法

分离效率高,分析速度快,适用范围广,准确度和线性优于薄层扫描法。是一种手工选择的中药制剂含量测定方法。95版第一版中12种药材及制剂的含量已用高效液相色谱法测定,并有增加趋势。

色谱条件的选择

反相高效液相色谱(RP-HPLC)和非极性固定相应用广泛,其中十八烷基键合硅胶(ODS)应用最为广泛。流动相为甲醇-水或乙腈-水的混合溶剂。使用反相色谱法,制剂中的极性添加剂等干扰成分先流出,不会留在色谱柱上污染色谱柱。如酸性成分,如丹参素、黄芩苷、甘草酸等。分离时,可向流动相中加入适量的酸,如乙酸和磷酸,以抑制它们的解离;对于酸性较强的组分,也可采用离子对色谱法,常用的抗衡离子试剂为四丁基氢氧化铵。对于碱性成分,如小檗碱和麻黄碱,通常使用反相离子对色谱,并在酸性流动相中加入烷基磺酸盐。无机阴离子,如磷酸盐,也可用作有机酸的抗衡离子。一般使用紫外检测器,灵敏稳定。