急！！！如何准确测量脂质体的粒径？
具有适当化学结构的亲脂性药物被包埋在双层膜中并被包封在脂质体中，其包封率取决于所用脂质的浓度。在这种情况下，包封率可以达到90%，因此不需要除去未包衣的药物。但对于水溶性药物来说，包封的药物只是总量的一部分，所以必须将未包衣的药物从脂质体混悬液中除去。因为脂质体比封装的药物分子大得多，所以我们可以利用它们的不同大小来分离和去除未包覆的药物。这些方法包括凝胶过滤柱层析、透析等。如果被包覆的物质是蛋白质或DNA，或者未被包覆的药物可能形成较大的聚集体，则可以利用它们与脂质体在浮力和密度上的差异，通过诸如离心的方法将它们分离。
(1)柱色谱法
凝胶渗透色谱(GPC)广泛用于从脂质体悬浮液中分离和去除未包衣的药物，并且它还可以用于对悬浮液中脂质体的大小进行分组。这项技术在实验室中非常有效和快速。在大规模生产中，虽然凝胶过滤也可以用于纯化，但该技术难度大且价格昂贵。此外，在脂质体被洗脱介质稀释后，可能需要增加浓缩步骤。
葡聚糖，如Sephadex G-50，常用作柱层析的填充材料，步骤与常规方法一致。但必须指出的是，①葡聚糖表面有微小的位点可以与脂质体膜结合，并相互作用。这种效应虽然不影响脂质体在凝胶柱上的流动特性，但仍可导致少量脂质的损失，增加膜的不稳定性，从而导致膜通透性的改变和被包裹物质的渗漏。在低脂浓度的情况下要特别注意这种现象，一般可以通过增加柱上脂质体的量或预先用空脂质体饱和柱来解决。通常20mg脂质制成的小单层脂质体可以饱和10g凝胶；②如果凝胶颗粒过细，较大的脂质体可能滞留在凝胶柱上，宜选择中粗凝胶(粒径为50 ~ 150？m)，但是任何等级的凝胶都可以用于小的单层脂质体。
(2)透析法
这种方法是去除未包衣药物(大分子化合物除外)最简单、最常用的方法。它不需要复杂的技术和昂贵的仪器，可以扩大生产。通过不断更换透析介质，可以清除所有游离药物。然而，这种方法很费时间。一般在室温下，要清除95%以上的游离药物，透析介质至少需要更换三次，时间在10 ~ 24h以上。此外，透析介质的渗透强度应与脂质体混悬液的渗透强度一致，否则，透析过程中脂质体混悬液的体积会发生变化，并可能造成包裹物质的渗漏。
(3)离心法
不同离心力下的离心是从不同种类脂质体中分离和去除游离药物的有效方法。为了彻底去除游离药物，往往需要反复悬浮离心。下沉脂质体所需的离心力取决于脂质体的大小，并在一定程度上取决于悬浮液的絮凝状态。如果脂质体小且分布窄，则需要高速离心和冷冻条件。低速离心(2000 ~ 4000 r/min)只能使大脂质体沉降。
显然，对于大量的脂质体采用高速冷冻离心是极其耗能和昂贵的，所以这种方法不适合分离小脂质体。对于较大的脂质体，低速离心可以缩短操作时间，同时将较稀的脂质体混悬液浓缩至所需浓度。为了避免脂质体的破坏，需要保证重复悬浮介质的渗透压与脂质体悬浮液的渗透压一致。
二、脂质体包封率的测定
(一)分包比例的确定。
显然，在研究被包封物质在生物体内的行为之前，有必要确定脂质体中被包封物质的量。通过用上述方法分离和除去未包封在脂质体中的游离物质，可以用下面的公式计算包封率。EN%)
En% = (1-CF/CT) × 100%
式中，Cf为游离药物的量；Ct是脂质体混悬液中药物的总量。
本文介绍两种快速、低剂量、适应性广的分离游离物质和测定EN%的方法。
1.微柱离心法。
取一个塑料注射注射器，用滤膜作为衬管，用生理盐水溶胀的Sephadex G-50填充，然后将注射器放入离心管中低速离心(2000 r/min，3min)，去除多余的生理盐水。此时可将凝胶柱干燥并与注射器内壁分离，准确定量加入脂质体样品，注意不要滴入柱床边缘，离心(2000 r/min，3min)。凝胶柱加入少量生理盐水，按上述方法离心。这次可能没有更多的脂质体或者仍然有少量的脂质体，这主要取决于脂质体的大小和组成。但游离药物在此过程中不会因葡聚糖吸附而分离。然后，向凝胶柱中加入生理盐水，离心干燥柱。此时，将游离药物洗脱到离心液中，重复几次，直到所有游离药物从柱中离心洗脱，然后分别测量包封药物和游离药物的浓度。
微柱离心的优点是脂质体混悬液几乎不被稀释，可用于分离去除未包衣药物，快速测定包封率，用于实验室小规模实验。
2.鱼精蛋白聚集法
这种方法可以用于任何组成的脂质体，例如中性或带负电荷的脂质体(图20-11)。该方法如下:
取0.1ml脂质体悬液于10ml锥形离心管中，加入0.1ml鱼精蛋白溶液(10mg/ml)，搅拌均匀，静置3min，加入3ml生理盐水，室温离心，吸取2ml上清液，测游离药物浓度。弃去剩余上清液，用0.6ml 10% Triton X-100重悬沉淀，溶解脂质体膜，加入生理盐水至总体积3.2ml，测定包封药物的浓度，即可方便地计算出EN%。
(2)包裹体积的确定
包封体积是指每毫克磷脂所占的脂质体相对于内水相的体积，一般用微升(？l)表示。包封体积的计算可以通过测量包封在脂质体中的药物总量来推断。如果脂质体中药物在水性介质中的浓度与制备开始时使用的浓度相同，并且在分离和除去未包衣的药物后没有物质从脂质体中漏出，则容易计算。但是，在很多情况下，这样的假设往往不能成立。例如，当通过二次乳化制备脂质体时，当通过干燥除去有机溶剂时，内部水相也可能损失；另外，由于内外渗透压的差异，水分子可以进入或逸出脂质体，所以确定内容积最好的方法是直接确定水量。例如，用具有光谱特性的液体代替内相介质，然后用核磁共振(NMR)测量水的量。脂质体在高速离心(200，000 g，6h)下沉淀成致密的沉淀物，小心除去上清液，沉淀物用D20(氧化氘)重悬。由于膜对水的通透性，整个体系中的H2O和D20很快达到平衡，少量取出用于磷脂含量的测定，剩下的可以通过水的核磁共振扫描。峰高与D20中的水浓度成正比，通过与标准溶液比较可以得到水的量。
第三，脂质体的稳定性
在脂质体放置的过程中可能发生许多不同的变化。比如磷脂会被氧化水解形成短链磷脂，在膜中形成可溶性衍生物；此外，脂质体还可以发生凝结、融合等物理变化，导致被包封物质的泄漏。因此，脂质体制剂如果要发展成为产品市场，必须在储存期间具有良好的稳定性。在到达体内目标组织或发挥其缓释作用之前，它还必须保持一定的大小和完整性。已有研究证明脂质体在血液中相对稳定，但脂质体在体内的稳定性会因磷脂的化学性质、胆固醇的比例、脂质体的大小和双层数的不同而不同。但是，如果药物在储存过程中迅速从脂质体中泄漏，脂质体的应用价值将受到限制。
(1)化学稳定性
在制备时应防止脂质体成分磷脂的氧化降解，可以采取一些措施尽可能降低氧化程度，如使用新鲜纯化的磷脂和新鲜蒸馏的溶剂，尽可能避免高温，在氮气和无氧条件下完成制备过程，最后将脂质体保存在惰性环境中。
在膜材料的组成中添加抗氧化剂也是一种有效的方法。目前常用的抗氧化剂是α-生育酚，它是一种无毒的食用油脂。据认为，添加α-生育酚可以大大减缓鸡蛋卵磷脂的氧化分解。降低氧化程度的另一种方法是使用饱和磷脂代替不饱和磷脂。在天然磷脂中，不饱和度依次随植物、蛋黄、哺乳动物增加。对于蛋黄磷脂，不饱和度取决于动物饲料和使用的纯化方法。
然而，在脂质体的水悬浮液中，不饱和磷脂和饱和磷脂都可以水解形成溶血磷脂和脂肪酸，溶血磷脂进一步水解形成甘油磷酸酯和脂肪酸。甘油和磷酸之间的酯键很难水解，所以不会产生游离磷酸和甘油。研究了精制天然大豆磷脂在脂质体水悬浮液中的水解动力学。结果表明，大豆磷脂的水解主要由H+和OH+催化，在pH6.5左右水解率最低，体系中加入缓冲离子如醋酸、柠檬酸和铵慢血酸也能略微增加大豆磷脂的水解。
(2)物理稳定性
包封在脂质体中的药物的物理稳定性，例如渗漏和凝结，以及融合成大块，是脂质体研究中的一个主要问题。有研究表明，小单层脂质体在储存过程中体积增大，药物渗漏与脂质组成和包封药物的性质有关。中性磷脂制备的脂质体的聚集主要是由范德华力相互作用引起的，在膜材料中加入少量带负电荷的磷脂(如10% PA或PG)可以克服这种聚集。在膜材料中加入少量的1，3-二乙酰-2-磷脂酰胆碱也能阻止较小脂质体的融合。
较大的脂质体在适当的制备方法下一般不会融合，而小于40nm的小单层脂质体由于膜的曲率较大，容易融合，尤其是在相变温度下。
脂质体在储存过程中的化学和物理变化可以通过使用前体脂质体等方法来重建脂质体来避免。重构脂质体有三种类型:含或不含药物的干脂膜；含或不含药物的冻干脂质混合物:含药物的冻干脂质体。对于干脂质膜或冻干脂质混合物，重建时获得的药物包封率有限，尤其是亲水性药物，混悬液中含有较多游离药物，实用价值不大。对于结构合适的亲脂性药物，重构产物可以达到满意的包封率，但重构过程中需要的条件，如搅拌的程度和方式，需要高于常温的超声波处理，不便于实际应用。
对于亲水性药物，可以选择含有药物的冻干脂质体作为重构形式。据报道，添加亲水性聚合物，如葡聚糖，可在冷冻过程中产生自由流动能量，有利于冻干脂质体在水介质中的重构。例如，含有胰岛素的冻干脂质体经此处理后，重构后的包封率可达70%，即冷冻重构过程中胰岛素的渗漏率约为30%。如果包装是低分子量药物，泄漏率可能会更高。然而，该技术提供了一种有效的方法来确保脂质体制剂在储存中的稳定性。
第四，脂质体大小的测定
脂质体的大小会影响脂质体在体内的处置，也是脂质体的重要质量指标之一。确定脂质体大小的方法包括激光扫描、电子显微镜或Coulter粒度分析。毫无疑问，电子显微镜方法是最准确的。因为人们可以直接观察每一个脂质体，获得各种尺寸范围内脂质体形状的准确信息。但是观察大量的脂质体样品是非常耗时的。相反，激光扫描方法非常简单和快速，但它只能测量脂质体的平均性质。同样，脂质体的粒度分布也可以用Coulter粒度分析仪测量，但后两种方法难以描述更精细的结构。颗粒尺寸测定的细节可以在本书的第12章找到。
5.脂质体的组成分析
(A)磷脂分析
1.含量测定
直接准确地测定磷脂的浓度是很困难的，因为干燥的磷脂中总含有一定量的残留溶剂或其他杂质磷脂，所以测定磷脂最广泛使用的方法是间接法，如磷含量的测定。对于大多数制备脂质体的磷脂来说，每摩尔磷脂含有65438±0摩尔磷，只有少数例外，例如每摩尔心磷脂含有2摩尔磷。因此，可以通过测量磷含量来计算样品中磷脂的浓度。这里有两种测定磷的方法。
(1)巴特利特法
磷脂的有机磷酸分解成无机磷后，加入钼酸铵使其转化为磷钼酸，用萘磺酸铵可定量还原成蓝色，用分光光度法测定蓝色的强度，与标准(如磷酸二氢钾)比较即可计算出磷含量。该方法灵敏度高，重现性好，但如果样品中含有少量无机磷，会干扰测定
(2)斯图尔特方法
当脂质体悬浮在磷酸盐缓冲液中时，此时应采用Stewart法。该方法中，磷脂与硫氰酸亚铁铵在有机溶剂中形成有色络合物，不受无机磷存在的影响。在计算中，使用与磷脂的结构相关的转换因子将吸收值转换成磷脂的毫克数，其随磷脂头基团而变化。也可以用磷脂标准溶液绘制标准曲线来计算。因此，该方法不适用于测定含有未知磷脂的混合物。特别要指出的是，该方法不能用于甘油磷酸酯的测定。如果脂质体含有卵磷脂和甘油磷酸酯，前者可用此法定量，然后用Bartlett法测定总磷脂，计算出甘油磷酸酯的量。
2.磷脂的薄层色谱
薄层色谱法是检查磷脂纯度的主要手段。与所有色谱方法一样，磷脂的薄层色谱也使用对液体有机相中亲水固定相具有不同亲和力的磷脂。液相在固定相中展开时，不同的磷脂有不同的保留时间，根据亲水性的强弱可以改变展开剂的组成，从而改变磷脂在两相中的分配系数。最常用的固定相是硅胶，展开剂通常是含有氯仿的溶剂。如①氯仿:甲醇:水:(65:25:4v/v)；②氯仿:甲醇:水:氨水(65:35:2.5:2.5v/v)；③氯仿:丙酮:甲醇:乙酸:水(6:8:2:2:1v/v)；④乙酸乙酯:环己烷(1: 1 v/v)等。最常用的显色剂是碘，也可用50%硫酸-甲醇溶液或重铬酸钾溶液显色。
(3)磷脂氧化的程度
1.磷脂的氧化
磷脂脂肪酸的氧化主要是由于自由基的作用。在电磁辐射或微量游离金属离子的催化下。首先从脂肪酸的碳链上去掉一个氢原子，形成自由基，然后自由基与空气中的氧气发生链式反应。含双键的碳链更易受影响，所以聚合不饱和磷脂特别容易氧化降解。在含有单个或多个不饱和脂肪酸的脂质混合物中，磷脂的氧化分为三个阶段:①单双键的偶联；②过氧化物的形成；③乙醛的形成和链的断裂。
值得注意的是，无氧情况下仍会发生自由基反应，导致形成双或三重偶联，但不会产生过氧化物。另外，最后一步降解消耗了偶联双键，所以在最终降解产物增加的同时，下一步降解产物会减少。因此，很难用一种试验方法来评价磷脂的氧化程度，即使应用几种不同的试验，也只能粗略估计氧化过程的相对速率。
2.氧化指数的测定
氧化指数是用于检测自由基偶联的指标，因为氧化磷脂在230nm附近有紫外吸收峰，与未氧化磷脂不同。典型的紫外吸收光谱如图20-12所示。
国内有人建议，卵磷脂作为制备脂质体的膜材料，其氧化指数应控制在0.2以下。测定方法是将卵磷脂溶于无水乙醇中，制成一定浓度的澄清溶液，分别在233nm和215nm波长处测定吸收值。按以下公式计算:
氧化指数= a233 nm/a215 nm。
3.过氧化物的测定
卵磷脂氧化产生丙二醛和溶血磷脂。丙二醛(MDA)在酸性条件下能与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成一种红色染料(TBA-dye)。
该化合物在波长535nm处有特异吸收，吸收值反映了磷脂的氧化程度。有人研究过丙二醛的多少和溶血的关系。实验证明，当含卵磷脂的生理盐水中丙二醛含量超过2.3？g、37℃放置65438±0 ~ 2小时发生溶血。
除了上述方法之外，还可以估计磷脂的氧化程度，并且根据聚合不饱和脂肪酸链在氧化最后阶段的断裂或缩短，通过气-液色谱法也可以了解这些酰基链的变化。
胆固醇的分析
与磷脂类似，胆固醇及其氧化产物的纯度可以通过气液色谱法检测。此外，由于胆固醇无论是游离的还是酯化的，都能与含高氯酸铁的乙酸乙酯和硫酸试剂反应生成铁络合物，在波长610nm处有紫外吸收，以标准胆固醇溶液为对照，可以计算出胆固醇的量。
6.脂质体的灭菌
许多研究论文认为脂质体不适合加热灭菌，对各种辐射和化学灭菌剂敏感，只能通过过滤灭菌或无菌操作制备。这也是影响脂质体在临床广泛应用的一个重要原因。
近年来国内有人成功采用100℃30min的湿热灭菌法。脂质体的形状和大小在灭菌前后无明显变化，渗漏率约为5%。另一个人用的是辐射灭菌法，即用60钴发出的γ射线对三磷酸腺苷脂质体和甲氨蝶呤脂质体进行灭菌。辐照剂量为15 ~ 20kGy，无菌试验结果由试验前的阳性转为阴性。灭菌前后脂质体粒径无明显变化。灭菌造成的泄漏率小。
灭菌方法的实用性可能与悬浮介质的类型、磷脂的组成和纯度有关。将几个脂质体在121℃加热20分钟灭菌。发现脂质体在生理盐水中凝结，而在等渗糖溶液和多羟基化合物溶液中不凝结。加热灭菌后，含有高过氧化值的鸡蛋卵磷脂的分散体变成微黄色，但当使用鸡蛋卵磷脂、氢化鸡蛋卵磷脂或低过氧化值的DPPC时没有变化。中性pH下充氮气也能防止变色，但加入α-生育酚无效。0.4之后？m膜过滤的鸡蛋卵磷脂组成的脂质体尺寸变小。在这种变化中，媒介的类型也有明显的影响。在加热灭菌过程中，包裹羧基荧光素阴离子的带负电荷的脂质体(PC/CHOL/PG)发生渗漏，而带正电荷的脂质体(PC/CHOL/十八胺)在加热灭菌过程中不仅没有渗漏，而且可以长期保存。