拓宽视野:铁下垂在癌症中的作用(一)

摘要:调控细胞死亡过程的发现促进了癌症治疗的进展。在过去的十年中，铁死亡，一种由过度脂质过氧化作用驱动的铁依赖形式的调节性细胞死亡，与各种类型肿瘤的发展和治疗反应相关。实验试剂(如erastin和RSL3)、已批准的药物(如索拉非尼、柳氮磺胺吡啶、他汀类和青蒿素)、电离辐射和细胞因子(如IFNγ和TGFβ1)可诱导铁死亡，抑制肿瘤生长。但铁诱导的死亡损伤可引发肿瘤微环境中炎症相关的免疫抑制，从而促进肿瘤生长。铁死亡对肿瘤生物学的影响尚不清楚，尽管一些研究发现了癌症相关基因突变(如RAS和TP53)、编码应激反应途径(如NFE2L2信号、自噬和缺氧)相关蛋白的基因突变、上皮-间质转化和激活铁死亡的治疗反应之间的重要相关性。在这里，我们介绍了铁死亡的关键分子机制，描述了铁死亡与肿瘤相关信号通路的相互作用，并讨论了铁死亡在全身治疗、放疗和免疫治疗中的潜在应用。

大多数癌症治疗策略旨在选择性地消除癌细胞，而不伤害非恶性细胞。调节性细胞死亡(RCD)过程中不同的致死子程序对肿瘤进展和治疗反应有不同的影响。与细胞意外死亡相比，RCD由特定的信号转导途径控制，这些信号转导途径可以通过药物或基因干预来调节。最广泛研究的RCD类型是凋亡、局灶性死亡、坏死和铁死亡，每种类型都有其独特的分子机制。死亡受体和线粒体途径是凋亡激活的两种最常见的机制，一个称为caspase的细胞内蛋白酶家族负责这些形式的RCD的有效期。焦炭死亡也是一个胱天蛋白酶依赖的过程，其有效期需要胱天蛋白酶1或胱天蛋白酶11介导的gasdermin D裂解释放其N端结构域，使其在质膜上寡聚形成孔。坏死的发生不是由胱天蛋白酶激活的，而是涉及其他效应分子，如假激酶MLKL，它被RIPK3介导的磷酸化激活。

铁死亡一词是2012提出的，指的是不受限制的脂质过氧化和随后的质膜破裂引起的铁依赖性RCD。铁死亡可由外部或内部手段诱导。外源途径通过抑制细胞膜转运蛋白如胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(也称为系统xc)或通过激活铁转运蛋白5-羟色胺转运蛋白和乳转铁蛋白来启动。内在途径通过阻断细胞内抗氧化酶(如谷胱甘肽过氧化物酶GPX4)来激活。尽管这一过程不涉及胱天蛋白酶、MLKL或gasdermin D的活性，铁死亡的效应分子仍有待鉴定。值得注意的是，氧化损伤(oxidative damage)是一种由谷氨酸介导的对神经细胞xc系统的抑制而引起的氧化损伤，具有类似于铁死亡的分子机制。

在过去的30年中，细胞凋亡得到了广泛的研究。然而，针对凋亡调节因子(如来自caspase或BCL-2家族的蛋白质)的治疗药物在肿瘤学中的临床应用仍面临挑战。对凋亡的抵抗是癌症的标志，因此靶向非凋亡RCD过程可能提供抑制肿瘤生长的替代策略。三个早期临床前观察支持某些致癌信号与铁死亡诱导之间的联系:(1)铁死亡激活剂eRAStin被鉴定，因为它能选择性地在含有突变型而非野生型ras的癌细胞中触发细胞死亡；(2)ras-RAF-MEK-ERK途径的激活对于由erastin诱导的细胞死亡是必需的，并且(3)已知铁对于癌细胞的增殖是重要的并且对于由erastin诱导的细胞死亡也是必需的。随后的研究发现了通过铁积累、脂质过氧化和膜损伤控制铁死亡的复杂信号通路。

作为肿瘤学中潜在的新靶点，该网络引起了极大的关注(表1)。特别是，对传统疗法有抗性或具有高转移倾向的癌细胞可能特别容易发生铁死亡，从而开辟了靶向治疗研究的新领域。作为对以往综述的补充，我们旨在深入了解铁死亡在肿瘤发展中的机制和作用，并将其作为潜在的治疗靶点。我们描述了肿瘤异质性和与铁死亡敏感阈值相关的信号，并强调了临床应用的潜在治疗药物。

铁积累和脂质过氧化是铁死亡过程中引起膜氧化损伤的两个关键信号。铁死亡的核心分子机制涉及调节氧化损伤和抗氧化防御之间的平衡。

与非恶性细胞相比，癌细胞(尤其是癌症干细胞)的生长强烈依赖于微量元素铁。流行病学证据表明，高膳食铁摄入量增加了几种癌症类型的风险(如肝细胞癌(HCC)和乳腺癌)。这些特征表明铁螯合药物(如去铁胺)或增加铁介导的毒性的药物(如索拉非尼、柳氮磺胺吡啶、他汀类和青蒿素)可用于治疗癌症患者。

在动物模型中，各种水平的干预(如增加铁吸收、减少铁储存和限制铁流出)引起的铁积累增加，通过整合的信号通路促进铁死亡。血清素转运蛋白或乳转铁蛋白介导的铁摄取通过转铁蛋白受体(TFRC)和/或另一种未知受体促进铁转运，而SLC40A1介导的铁输出抑制铁转运。铁蛋白(一种铁储存蛋白)的自噬降解通过增加细胞间铁水平来增强铁死亡，而外来体介导的铁蛋白输出抑制铁死亡。参与铁-硫簇生物发生中铁利用的几种线粒体蛋白(包括NFS1、ISCU26、CISD1和CISD2)可能通过降低有效氧化还原活性铁含量来负调节铁死亡。过量的铁通过至少两种机制促进随后的脂质过氧化:依赖于铁的芬顿反应产生活性氧和含铁酶的激活(例如脂肪氧合酶)。因此，铁螯合剂和抗氧化剂可以预防铁中毒。铁螯合剂去铁胺联合常规动脉化疗栓塞的安全性和有效性目前正在不可切除HCC患者中进行研究(NCT03652467)。

铁死亡过程中，多不饱和脂肪酸(PUFAs)，特别是花生四烯酸和肾上腺素酸，容易发生过氧化反应，导致脂质双分子层的破坏，影响膜功能。酶ACSL4和LPCAT3是细胞膜中多不饱和脂肪酸的生物合成和重塑所需要的。ACSL4催化游离的花生四烯酸或肾上腺素酸与辅酶a结合，分别形成衍生物AA-CoA或AdA-CoA，然后LPCAT3促进它们酯化磷脂酰乙醇胺，形成AA-PE或AdA-PE。ACSL3将单不饱和脂肪酸(MUFAs)转化为其酰基辅酶a酯，以结合膜磷脂，从而保护癌细胞免受铁敏感性的影响。AMPK介导的beclin1磷酸化通过抑制还原型谷胱甘肽(GSH)的产生来促进铁死亡，而AMPK介导的ACAC磷酸化被认为通过限制PUFA的产生来抑制铁死亡。这些研究扩展了AMPK的已知功能，并揭示了AMPK作为能量传感器的作用，它通过不同下游底物的磷酸化来决定细胞的命运。过氧化物酶体介导的缩醛磷脂生物合成为缺铁时脂质过氧化提供了另一种PUFA来源。最后，不同的脂氧合酶在介导脂质过氧化产生氢过氧化物AA-PE-OOH或AdA-PE-OOH中是环境依赖性的，它们促进铁死亡。例如，脂氧合酶ALOX5、ALOXE3、ALOX15和ALOX15B负责来源于各种肿瘤类型的人细胞系(BJeLR、HT-1080或PANC1细胞)中的铁死亡，而ALOX15和ALOX65438+。

几种膜电子转移蛋白，特别是POR和NADPH氧化酶(NOXs)，有助于铁死亡的脂质过氧化中活性氧(ROS)的产生。在其他情况下，哺乳动物线粒体电子传递链和三羧酸循环，加上谷氨酰胺分解和脂质合成的信号，参与了铁死亡的诱导，尽管线粒体在铁死亡中的作用仍有争议。当新的治疗方法可用时，进一步评估脂质过氧化调节物在不同类型肿瘤中的表达谱以指导患者的选择是非常重要的。

抗氧化酶GPX4可以直接将磷脂氢过氧化物还原为羟基磷脂，从而充当癌细胞中铁死亡的中枢阻遏物。GPX4表达和生存结果的关系依赖于肿瘤类型。例如，GPX4的高表达水平与乳腺癌患者的预后呈负相关，但与胰腺癌患者的良好生存结局呈正相关。GPX4在铁死亡中的表达和活性依赖于谷胱甘肽和硒的存在。谷胱甘肽由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸合成。半胱氨酸的可用性是这一过程中的主要限制因素。在哺乳动物细胞中，xc系统在将胱氨酸(半胱氨酸的氧化形式)引入细胞以用于随后的GCL介导的谷胱甘肽生产中起主要作用。系统xc由SLC7A11和SLC3A2两个子单元组成。SLC7A11的表达和活性进一步受到NFE2L2的正调控和肿瘤抑制基因如TP53、BAP1、BECN1的负调控。这种双重调节构成了控制铁死亡中谷胱甘肽水平的微调机制。谷胱甘肽的其他来源可能包括反式硫化途径，该途径受氨酰基-tRNA合成酶家族负调控，如CARS1，CARS1的一些多态性与胃癌风险增加有关。GPX4以谷胱甘肽为底物，将膜脂氢过氧化物还原为无毒的脂肪醇。GPX4中半胱氨酸残基取代硒代半胱氨酸(U46C)增加了其抗铁死亡能力。对系统xc(用erastin、柳氮磺胺吡啶或索拉非尼)或GPX4(用RSL3、ML162、ML210、FIN56或FINO2)的药理学抑制诱导铁死亡。同样，SLC7A11或GPX4的基因缺失会导致脂质过氧化，导致某些细胞或组织的铁死亡。GPX4缺失还介导小鼠的其他RCD过程(如凋亡、坏死和焦死)，表明脂质过氧化处于这些途径的十字路口，尽管下游效应物可能不同。

一些非GPX4途径，包括AIFM 2–CoQ 10，GCH 1–BH4和ESCRT- III膜修复系统，也在防止铁死亡过程中的氧化损伤中发挥作用。这些修复途径之间可能存在协同或互补效应。事实上，AIFM2调节还原性CoQ10的产生，但它也可以通过激活ESCRT-III膜修复系统来阻止癌细胞的铁死亡。

RAS家族(HRAS、NRAS和KRAS)的癌基因是所有人类癌症中最常见的突变。在索托菲尼发现之前，这些蛋白质被认为是“不可消化的”。索托菲尼是KRAS-G12C突变蛋白的直接抑制剂，其在非小细胞肺癌患者中具有良好的活性，尽管对该化合物的获得性耐药很常见。Ada Griesi是KRAS-G12C的另一种选择性抑制剂，在KRAS-G12C阳性非小细胞肺癌和其他实体瘤患者中也显示出令人鼓舞的临床活性。ras信号传导的其他间接策略依赖于筛选RAS依赖性生长抑制剂或特定细胞死亡诱导剂时识别的小分子。铁死亡诱导剂eRAStin和RSL3对工程ras突变肿瘤细胞显示选择性致死作用。对RAS或其下游信号分子(BRAF、MEK和ERK)的遗传或药理学抑制逆转了erastin和RSL3的抗癌活性，可能是因为突变的RAS信号通过调节铁代谢相关基因(如TFRC、FTH1和FTL19)的表达丰富了细胞铁库。KRAS突变肺腺癌细胞对SLC7A11抑制剂诱导的铁敏感；此外，EGFR上游突变的非小细胞肺癌衍生细胞对铁死亡敏感。这些临床前的发现支持了这样的观点，即诱导铁死亡可能是对抗致癌的RAS携带的肿瘤的适当策略。

在临床前研究中，癌基因RAS突变体(NRASV12，KRASV12和HRASV12)的异位表达降低了RMS13横纹肌肉瘤衍生细胞对铁死亡的易感性，表明这些突变在某些情况下可能抑制铁死亡。此外，对117癌细胞系对erastin的反应的分析揭示了RAS依赖性和RAS非依赖性铁死亡的机制，并且这些破译使一些癌症容易发生铁死亡的特定遗传特征的尝试正在进行中。

在大约50%的人类癌症中，TP53是双等位基因突变或缺失，这导致野生型P53活性的丧失和肿瘤进展。所有人类癌症中最常见的六种TP53突变包括R175H(5.6%)、R248Q (4.37%)、R273H (3.95%)、R248W (3.53%)、R273C (3.31%)和r282w (2.73%)。众所周知，p53是一种转录因子，它与目的基因的启动子结合，然后激活或抑制基因合成。例如，p53主动调节BBC3(也称为PUMA)和BAX的表达以诱导凋亡。相比之下，SLC7A11的p53介导的转录抑制促进癌细胞的铁死亡。TP53的改变(突变或多态性)改变了P53促进细胞凋亡和铁死亡的能力。p53 3KR (K117R，K161R，K162R)乙酰化缺陷突变体不能诱导细胞凋亡，但完全保留了诱导肺癌细胞系铁死亡的能力。另一种乙酰化缺陷突变体p53 4KR(K98R和3KR)和p53 P47S(p53 n端反式激活域的一种多态性)不能诱导铁死亡。有趣的是，p53 R273H和R175H虽然不能与DNA结合，但仍然可以通过抑制其他转录因子的活性来抑制SLC7A11的表达，从而说明整合的转录因子网络控制着铁死亡主要调控因子的表达。

一些代谢相关基因，如SAT1、FDXR和GLS2，已被报道为在各种条件下负责p53介导的铁死亡的直接靶标，因此强调了p53作为参与铁死亡代谢的基因的调节剂的重要性。P53还能够通过直接结合二肽基肽酶DPP4来抑制人结肠直肠癌细胞中由氮氧化物介导的脂质过氧化，或者通过诱导纤维肉瘤细胞中CDKN1A的表达来限制铁死亡。DPP4抑制剂(如维格列汀、阿格列汀和利那列汀)用于降低二型糖尿病患者的血糖水平，并可能限制铁死亡激活剂的抗癌活性。迄今为止发表的数据不仅表明脂质过氧化是铁死亡的关键因素，而且单个p53靶基因或结合蛋白在铁死亡中的总体重要性可能是细胞类型特异性的。此外，MDM2和MDMX这两种结合p53并调节其稳定性的蛋白质以独立于p53的方式促进癌细胞中的铁死亡，从而强调铁死亡中p53的稳定性可能不依赖于MDM家族的蛋白质。Eprenetapopt和COTI-2都旨在重新激活突变型p53，目前正用于急性髓系白血病(AMLNCT03931291)和各种实体恶性肿瘤(NCT04383938和NCT 02433626)。这些药物的临床活性可能与铁死亡有关。

NFE2L2是氧化应激信号的主要调节者，在肿瘤进展中起着双重作用:NFE2L2活性不足可导致肿瘤早期发生，而NFE2L2活性高可引发肿瘤进展和对治疗的抵抗。NFE2L2在癌细胞中的表达不仅受KEAP1介导的蛋白降解调控，还受癌基因信号通路(如KRAS-BRAF-MYC)的转录调控。临床前研究表明，NFE2L2信号是对抗铁死亡的重要防御机制，它与HCC细胞对索拉非尼的耐药性有关。Sequestome 1是一种多功能支架蛋白，它可以结合KEAP1，并阻止其在癌细胞铁死亡过程中与新合成的NFE2L2结合。

NFE2L2激活铁代谢(包括SLC40A1、MT1G、HMOX1和FTH1)、谷胱甘肽代谢(包括SLC7A11、GCLM和CHAC1)和ROS解毒酶(包括。AKR1C1、AKR1C2和AKR1C3、SESN2、GSTP1和NQO1)抑制铁死亡中的氧化损伤。NFE2L2中的功能获得突变或KEAP1中的功能丧失突变进一步增加了氧化应激的复杂性，进而可能影响对铁死亡的抵抗。NFE2L2对铁死亡抗性的贡献以及NFE2L2抑制剂(如布鲁塞尔醇和葫芦巴碱)增强铁死亡的治疗潜力需要在临床前和临床研究中进一步探索。

缺氧促进肿瘤形成和治疗抗性。缺氧诱导因子是缺氧的主要调节因子，由一个氧不稳定α亚单位(包括缺氧诱导因子1α、EPAS 1α(也称为缺氧诱导因子2α)和缺氧诱导因子3α)和一个组成型表达的β亚单位(ARNT)组成。在正常氧条件下，EGLN家族成员羟基化缺氧诱导因子1α和epas1α，然后被E3泛素连接酶VHL识别进行蛋白酶体降解。在低氧条件下，羟化酶的失活导致HIF1α和EPAS1的积累，并与ARNT形成异二聚体，从而诱导参与低氧适应和存活的基因的转录。HIF1α和EPAS1在许多癌症类型中的表达增加，这通常与患者的不良预后有关。

在临床试验中，已经探索了使用小分子如2-甲氧基雌二醇(NCT00030095)、BAY 87-2243 (NCT01297530)、PX-478 (NCT 0052652)和PT2385来抑制缺氧诱导因子信号的策略。在这些药物中，PT2385可以略微提高转移性透明细胞肾细胞癌患者的生存率，而长期使用PT2385会导致耐药。在临床前研究中，缺氧诱导因子似乎在调节癌细胞铁死亡中具有双重作用。EGLN用于催化缺氧诱导因子的羟基化，缺氧诱导因子不仅是氧的铁依赖型传感器，也是半胱氨酸的铁依赖型传感器。铁螯合剂可能通过抑制EGLN的活性来提高缺氧诱导因子的稳定性。在HT-1080纤维肉瘤细胞中，缺氧诱导的HIF1α表达通过增加脂肪酸结合蛋白3和7的表达抑制铁死亡，从而促进脂肪酸摄取，增加脂质储存能力，避免后续的脂质过氧化。相反，在来源于肾细胞癌的细胞中，EPAS1的激活通过上调HILPDA的表达促进铁死亡，从而增加PUFA的产生和随后的脂质过氧化。相反，在来源于肾细胞癌的细胞中，活化的EPAS1通过上调HILPDA的表达促进铁死亡，从而增加PUFA的产生和随后的脂质过氧化。因此，必须有效控制缺氧诱导因子介导的信号，以维持脂质稳态，调节铁死亡反应。如果以肿瘤细胞中铁死亡调节蛋白基因的表达作为纳入/排除标准，缺氧诱导因子抑制剂在临床试验中的使用可能会有所提高。

上皮-间质转化(EMT)是上皮细胞失去与上皮表型相关的极性和细胞间粘附，逐渐获得与间质表型相关的迁移和侵袭的过程。在临床实践中，EMT被认为产生肿瘤干细胞，导致转移扩散和耐药。转录因子如SNAI1、TWIST1和ZB1刺激EMT介导的肿瘤转移和耐药性，是肿瘤学中潜在的治疗靶点。除了限制大多数抗癌治疗的有效性，EMT信号还可以促进铁死亡(图3)。人类癌细胞系和器官样细胞中的高间充质样细胞状态与铁死亡的易感性相关。ZB1的高基线转录水平与细胞对铁死亡的敏感性有关，这部分是由于ZB1诱导肝脏脂质代谢的主要调节剂PPARγ的上调。LYRIC是EMT的正调节剂，通过抑制GPX4和SLC3A2的表达促进铁死亡。CD44依赖性铁内吞的增加促进了铁依赖性脱甲基酶的活性，从而促进了EMT信号转导相关基因的表达，从而使乳腺癌细胞对铁死亡敏感。这些临床前研究的数据表明，EMT可能对铁死亡治疗敏感。

EMT的第一步包括上皮细胞之间接触的中断。据报道，钙粘蛋白1介导的细胞间接触可防止铁死亡。相反，SNAI1、TWIST1或ZB1的表达增加可以恢复铁死亡敏感性。其他细胞粘附促进剂，如整合素亚单位α6和β4，也可以保护乳腺癌衍生细胞免受体外铁死亡。相比之下，参与HIPPO通路的转录因子(如YAP1和WWTR1(也称为TAZ，通常在发育过程中控制细胞数量和器官大小)的激活通过调节铁死亡调节因子(如ACSL4、TFRC、EMP1和ANGGPTL4)的表达促进癌细胞的铁死亡。总的来说，这些发现强调了使用铁死亡诱导药物特异性消除具有间充质表型的癌细胞的理论可能性。

待续............