MTT实验前期如何确定细胞密度和计算药物浓度

1.选择合适的细胞接种浓度。一般来说，96孔培养板满的时候，一个内贴壁细胞大约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后的面积差异很大，因此在MTT试验前，需要进行前期实验，检测不同接种细胞条件下的贴壁率、倍增时间和生长曲线，并在试验中确定每个孔中的接种细胞数和培养时间，以确保终止培养后细胞过满。这样就可以保证MTT晶体数量和细胞数量之间的线性关系。否则细胞太多会降低灵敏度，细胞太少观察不到差异。

药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的成果，然后设定一个更大的范围先筛选。根据你初筛的结果缩小浓度和时间范围，再细筛。记住！否则可能就是你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3.时间点的设置。测定不同时间点的OD值，输入excel表格，最终得到不同时间点的抑制率变化，绘制变化曲线。当曲线变得平缓时(平台期)，那个时间点应该是最佳时间点(因为此时对细胞增殖的抑制作用最明显)。

4.文化时间。200ul培养基对处于增殖期4 ~ 5次方的10细胞难以维持68小时。如果营养不足，细胞会逐渐从增殖期转入G0期并趋于静止，从而影响结果。我们在48小时后更换了培养基。

⒌MTT法只能测定细胞的相对数和活力，而不能测定细胞的绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也会导致MTT比色OD值升高。

所有的理论不一定都是对的。要根据自己的实际情况进行调整。

实验中应设置⒎调零孔、控制孔和加药孔。在调零孔中加入培养基、MTT和二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加入细胞、培养基、MTT和二甲基亚砜，不同的是对照孔加入药物溶解培养基，而加药组加入不同浓度的药物。

⒏避免血清干扰。细胞在含15%胎牛血清的培养基中培养时，高血清物质会影响测试孔的吸光值。由于测试背景的增加，将测试灵敏度。所以一般选择胎牛血清小于10%的培养基。着色后，尽量吸干培养孔内残留的培养液。一种MTT溶液的制备方法

通常，该方法中MTT的浓度为5mg/ml。故称取0.5g MTT，溶于100 ml磷酸盐缓冲液(PBS)或不含酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤除去溶液中的细菌，4℃避光保存。在准备和储存的过程中，最好用铝箔纸包裹容器。

需要注意的是，MTT法只能用于检测细胞的相对数和活力，而不能检测细胞的绝对数。为了保证实验结果的线性，MTT吸光度应在0-0.7的范围内。

一般MTT最好现配，4℃两周内有效，过滤后避光，也可配制成5mg/ml，长期-20℃保存，避免反复冻融。最好小剂量包装，用避光袋或黑纸或锡箔纸包裹，以免分解。我一般都是把MTT粉装在EP管里，现在用的时候搅拌一下，直接加到培养皿里。没必要一下子混那么多，尤其是MTT变成灰绿色的时候。

MTT致癌，用的时候要小心。如果可能的话，最好戴那种透明膜手套。制备的MTT需要无菌且对细菌敏感。加到96孔板时不避光也没关系。毕竟时间紧迫，还是不放心的时候可以关掉手术台上的灯光。

在配制MTT时，用PBS溶解，也有人用生理盐水配制，用60℃水浴帮助溶解。