原代培养在生命科学研究中有什么应用？它的优点是什么？

原代培养又称原代培养，是从供体获取组织细胞后的第一次培养。其特点是细胞或组织刚刚离开机体，其生物学特性没有发生大的变化，在一定程度上反映了其在体内的状态，表现出原组织或细胞的特征。原代培养是药物实验研究的良好实验技术。因为原代培养的组织中含有多种细胞成分，即使培养出同类型的细胞，细胞之间也有很大的差异。如果供体不同，即使组织的类型和部位相同，个体差异也可以体现在细胞上。因此，原代培养细胞的某些生物学特性不够稳定，需要细胞短期传代，才能进行严格的对比实验研究。近年来，原代培养技术已广泛应用于中药研究，尤其是中药研究。1原代培养技术1.1组织块培养法，即将组织切成小块后接种到培养瓶中，简单易行，成功率高。但由于反复剪切和接种过程容易对组织块造成损伤，并不是每个小块都能长出细胞。该方法适用于少量细胞的原代培养，如牙髓细胞培养。1.2消化培养法利用酶制剂(最常用的是胰蛋白酶)处理组织块，去除细胞间物质，使细胞相互分离，形成单细胞悬液，多形成单层细胞生长方式。这种方法的优点是单层细胞更容易吸收营养和排泄代谢产物，因此生长更快。但操作不慎容易造成污染，消化处理一定要恰到好处，否则会对细胞造成一定伤害。随着实验技术的提高，该方法在研究中得到广泛应用[1]。2原代培养技术在中药研究中的应用从近十年的文献报道来看，体细胞、血细胞和肿瘤细胞的原代培养技术比较成熟，并已应用于中药研究，尤其是肝细胞和神经细胞的原代培养，应用更为广泛。2.1用于中药药理研究。中药药理研究是目前原代培养技术应用最广泛的领域，称为中药生物效应研究，了解中药的细胞药理和毒理作用。与整体体内实验相比，体外实验具有简单、快速、条件易控、药理靶点和环节明确等优点。2.1.1用于药效学研究。利用原代培养技术研究中药及复方有效成分的作用和机理是一种重要手段。朱令群等[2]发现，原代培养的大鼠海马神经元缺氧缺糖5 h，再给氧，可诱导神经元凋亡和细胞坏死，细胞内Ca2+浓度和乳酸脱氢酶释放显著增加，并随复氧时间延长而增加；三七总皂苷可降低神经细胞凋亡和坏死的百分比，降低细胞内Ca2+浓度，减少乳酸脱氢酶的释放，其作用随剂量的增加而增强。Shih等[3]发现川芎提取物川芎嗪能保护原代培养的大鼠海马神经元线粒体，减少自由基的产生，帮助清除自由基，从而对红藻氨酸引起的细胞损伤起到保护作用。刘小玲等[4]原代培养大鼠滑膜细胞，发现青藤碱可以通过抑制滑膜细胞的恶性增殖和白细胞介素-6 mRNA基因的表达来阻断滑膜炎的进展。Oi Wah Lam等[5]报道汉防己甲素能明显抑制气道平滑肌细胞的增殖活性。粉防己碱对组胺引起的[Ca2+] I升高有明显的抑制作用。推测粉防己碱对培养的气道平滑肌细胞增殖活性的抑制作用可能是通过阻断细胞膜上的Ca2+通道，降低[Ca2+] I来实现的，Bickmeyer等[6]报道粉防己碱可阻断原代培养的牛嗜铬细胞的电压依赖性钙通道，促进儿茶酚胺的释放，提高细胞内钙水平。崔云华等[7]原代培养大鼠肝星状细胞，发现丹酚酸B可降低活化和丙二醛刺激的肝星状细胞的氧化程度，抑制增殖细胞核抗原的表达，可能与抗氧化和抗增殖有关。李等[8]原代培养中脑神经元和胶质细胞，发现从雷公藤中提取的雷公藤内酯醇能对抗脂多糖引起的细胞内多巴胺吸收减少和酪氨酸羟化酶免疫活性丧失，抑制小胶质细胞的活性和肿瘤坏死因子α、一氧化氮的过度产生。雷公藤内酯醇还能保护多巴胺能神经元免受脂多糖的损伤，其机制可能是抑制小胶质细胞的活性。Kamei等[9]通过原代培养技术培养大鼠脂肪细胞和心肌细胞，首次在体外实验中证实中药提取物紫草素具有胰岛素样作用。Hsu等[10]利用原代培养技术培养中性粒细胞，发现灵芝多糖能促进中性粒细胞的运动，增强蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶和酪氨酸激酶的活性，从而增强中性粒细胞的趋化性和吞噬能力。王等[11]报道白术中提取的有效成分苍术酮对原代培养的人白血病单核细胞有一定的细胞毒性。万文成等[12]发现清开灵能减少谷氨酸引起的原代培养大鼠大脑皮层神经元乳酸脱氢酶的渗漏，减轻细胞形态学改变，表明清开灵能对抗谷氨酸介导的兴奋毒性，对培养的大鼠大脑皮层细胞有保护作用。脂多糖刺激10 h后，核转录因子-κB的活性达到峰值，最高荧光强度位于细胞核内。大剂量温脾汤血清能明显抑制核转录因子-κB的活性；大剂量药物血清可明显抑制核转录因子-κ B抑制剂I κ B的降解，Thomas lee等[14]利用血清药理学方法和心肌细胞原代培养技术，发现在含通脉汤的血清干预下，缺氧心肌细胞内游离钙离子浓度明显降低，缺氧条件下细胞膜L型钙离子通道表达也明显降低，表明通脉汤可降低缺氧心肌细胞的钙超载。尤红等[15]的实验结果表明，一定浓度的化合物861(由丹参、黄芪等十种中药组成)能促进体外分离培养的大鼠肝细胞DNA合成，但对肝细胞凋亡无明显作用。张斌等[16]在大鼠肝纤维化原代培养中观察到抗纤维化复方对贮脂细胞自分泌的影响。结果表明，抗纤维化复方药物血清能明显抑制贮脂细胞产生转化生长因子β1，阻断肝纤维化过程中贮脂细胞的自分泌。Imanishi等[17]采用原代培养技术培养肝星状细胞，用硫代乙酰胺制作肝纤维化模型。结果表明，茵陈蒿汤主要通过抑制血小板衍生生长因子B受体的磷酸化和信号转导通路的下降来抑制DNA的合成和转录，这可能是茵陈蒿汤治疗肝纤维化的机制。张等[18]原代培养胎鼠皮层神经元，谷氨酸损伤神经元，使胆碱酯酶和链霉亲和素标记过氧化物酶活性降低，乳酸脱氢酶释放增加。加入清脑益智方血清后，上述酶的活性可恢复到正常水平，一氧化氮的产生和细胞凋亡也受到抑制。2.1.2方剂配伍机制研究刘成海等[19]将扶正化瘀319方拆方，分别制备药物血清，作用于原代培养肝细胞。结果表明，药物血清对细胞形态无明显影响，但对肝细胞白蛋白分泌和前白蛋白mRNA表达有不同程度的促进作用，其中以扶正化瘀319全方最为显著。2.2针刺研究梁希斌等[20]观察了电针后大鼠腹侧中脑粗提物对体外多巴胺能神经元表达数量、胞体直径和突起长度的影响。实验证实，电针后大鼠腹侧中脑粗提物可促进多巴胺能神经元的发育和突起的生长，但对多巴胺能神经元的表达数量无明显影响。2.3中医证候本质研究陈云波等[21]通过在血瘀证家兔模型中直接培养血管内皮细胞，在血瘀证家兔模型血清中培养血管内皮细胞，建立血瘀证细胞损伤模型。原代培养的血管内皮细胞出现病理损伤和内分泌功能改变。此外，模型组原代细胞培养液中一氧化氮含量明显低于对照组，而内皮素含量呈上升趋势。证明实验建立的细胞损伤模型在功能和结构上能够反映血瘀证整体动物模型和部分临床患者的病理特征，可用于研究血瘀证的本质和活血化瘀的机理。3原代培养技术应用于中药研究的问题与展望3.1加强相关基础研究原代培养能首次成功传代形成细胞系，通过选择或克隆形成从原代培养或细胞系中获得的具有特殊性状或标记的培养物称为细胞系。经细胞生物学命名和鉴定的各种细胞系或株系，是形态相对均一、生长增殖稳定、生物学特征明确的细胞群。细胞系分裂繁殖过程中形成的单层有利于培养，也可以将细胞冷冻起来用于后期培养。一般来说，细胞系优于原代培养。细胞系已广泛应用于中医药研究，如各种肿瘤细胞、肝星状细胞系、巨嗜细胞系、转染乙肝病毒基因的肝细胞等。，主要用于中药的药效学研究。但毕竟还是有很多细胞无法获得细胞系(株)，尤其是在现阶段的中国，稳定的细胞系和细胞株都不容易获得，原代培养的细胞至少提供了一个体外细胞水平实验的工具。因此，有必要加强细胞培养的基础研究，将更多的细胞系(株)应用于中医药研究领域，使中医药研究在细胞水平上得到提高。目前国内外已经有很多关于人体细胞培养的研究，其细胞大部分来自器官捐献者。国内这方面的研究工作很少，中医药领域的研究才刚刚开始。由于伦理道德等因素的制约，其适用范围仍然狭窄。目前主要用于一些容易获得的细胞，如子宫内膜细胞、人牙髓细胞、角质形成细胞(来自手术切除的包皮)、血细胞和血管内皮细胞(来自脐带)，以及一些手术切除的细胞，如肿瘤细胞和腹主动脉瘤的血管平滑肌细胞。细胞培养技术研究中药的关键技术之一是中药的给药方法，这方面的基础研究越来越受到重视。目前中药药效学研究主要有两种给药途径:(1)直接添加。水煎醇提等方法对中药复方进行粗提。，直接添加到培养系统中，或冷冻干燥，用培养液稀释并添加到培养系统中。这种方法简单，但易受杂质、pH值、渗透压、电解质等因素的影响。国内外相关研究中已有中药有效成分直接添加的实验报道。(2)间接加法(血清药理学方法)。灌胃给予动物化合物，收集服药后的动物血清，将含药血清加入培养的细胞中。这种方法避免了体外用药的一些干扰因素，但起步较晚，需要进一步完善。3.2中药理论研究细胞培养技术主要用于中药研究，尤其是药效学研究，并已取得多项成果。到目前为止，研究的目的大多局限于验证临床有效的复方或探索其可能的作用机制，但这显然是不够的。发挥体外实验的优势，深入研究中药复方、剂量、辨证论治的奥秘，进而推陈出新，对中医药的发展和中医药走向世界具有重要意义。此外，应用细胞培养技术阐明中医理论的本质也是一个值得探索的领域。如吴等人[23]提出中医“证”(虚证和偏实证)的本质是细胞内基因诱导表达的细胞因子。中医“证”的分子机制是细胞因子网络稳态平衡被破坏的结果。阴虚证的本质可能是由于白细胞介素1和肿瘤坏死因子基因表达增强，生物活性相对增加，导致细胞因子网络稳态失衡。已有一些研究证候本质的实验，如血瘀证血管内皮细胞病理模型的建立及其相关研究。郑爱华等[24]讨论了肝郁证和脾虚证模型动物IFN-γ和IL-4 mRNA表达的变化。由于中医理论更注重整体而忽略微观原因，在细胞和分子水平上对中医基础理论的研究相对较少。利用细胞培养技术开展这方面的深入研究，可以促进中医基础理论的进一步发展。