硅胶柱色谱操作技术

利用吸附原理，即利用硅胶对中药混合物中各种成分吸附能力的差异，将混合物中的成分进行分离。

硅胶柱色谱的操作方法及注意事项；

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操作要点:装柱前，柱底要垫一层脱脂棉，防止吸附剂漏出。有两种方法:干包装和湿包装。

(1)干填充柱:硅胶通过漏斗填充入柱，不间断，形成细流，缓慢加入管中。也可以用橡皮锤轻轻敲击硅胶柱，使硅胶填充连续、均匀、紧密。装柱后，打开下端活塞，然后倒入洗脱用的洗脱液，排出柱内空气，并保持一定液位。

(2)湿柱上样:将最初准备使用的洗脱液装入柱中，打开下活塞，使洗脱液缓慢流出。然后将硅胶缓慢连续倒入柱中(或将硅胶与适量洗脱剂混合成悬浮液，缓慢加入柱中)，硅胶在重力和洗脱剂的驱动下在柱中自由沉降，流出的洗脱剂要不断补充回柱中，保持一定的液位，直到硅胶完全加入并沉降在柱中。然后在硅胶上加一小片滤纸或者一点脱脂棉。根据样品量，将洗脱液的液位控制在一定高度。

(3)均质法:搅拌成匀浆。加入两倍干硅胶体积的溶剂，用玻璃棒搅拌。如果洗脱液是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，用石油醚混合；如果洗脱剂是氯仿/乙醇系统，用氯仿混合。如果不能搅拌成匀浆，说明溶剂中水分含量过高，尤其是乙酸乙酯/丙酮。如果分配色谱不与水混合，必须事先用无水硫酸钠干燥很长时间。用无水氯化钙干燥氯仿以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，氯仿系统不能用于通过色谱柱。

样品装载

将待分离样品溶解在少量上柱用的洗脱液中，制成小体积、高浓度的样品溶液，加到色谱柱中的硅胶表面。如果样品不溶于上柱所用的洗脱液，将样品溶于挥发性溶剂中，加入适量硅胶(不超过柱中硅胶总量的1/10)混匀。除去溶剂后，将混有样品的硅胶均匀地加到柱的顶部(始终保持洗脱液在一定的水平)，然后盖上一层硅胶。

上样时注意沿柱内壁缓慢加入，始终保持硅胶上表面平整；硅胶的装载量为1/60~1/30。

洗提

洗脱剂的选择可以通过TLC进行筛选。一般薄层色谱展开时Rf值为0.2~0.3的溶剂系统为最佳洗脱系统，采用梯度洗脱法进行洗脱。

首先打开柱下端的活塞，保持洗脱液流速为1~2滴/秒。洗脱液连续加入到上端(加入速度可以通过分液漏斗控制，以类似于下端的流出速度)。如果单一溶剂洗脱效果不好，可以用混合溶剂进行洗涤(一般不超过三种溶剂)，通常采用梯度洗脱。洗脱液的洗脱能力由弱到强逐渐增强。

收集和处理

将洗脱液分成等份收集，每份收集的量大约相当于所用硅胶的量。通过TLC定性检查每种洗脱液，合并含有相同组分的洗脱液。单体组分通常可以在浓缩和重结晶后获得。如果还是几种单体成分的混合物，就不容易分出单体成分的晶体。需要进一步的色谱或其他分离方法。？

注意:

(1)柱层析的分离能力优于薄层层析，特别是对于结构相似、性质相近、薄层层析难以分离的组分。

(2)不用含水的混合溶剂洗柱，尽量不用。