如何制备蚕丝蛋白水解物？越详细越好，非常感谢！
1.1实验材料
1.1.1原辅材料
蚕丝、葛根、枳椇子、乌梅都是在徐州市场购买的。蔗糖、中性蛋白酶(130000 u/g)、胰蛋白酶(4000 u/g)由实验室提供，木瓜蛋白酶(650000 u/g)由广西海发生物酶制品厂提供。
1.1.2主试剂
甲醛试剂、浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、无水氯化钙、氯水、邻苯二甲酸氢钾、甲基红、硫酸铜、硼酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、盐、731和723阴离子交换树脂，以及1体积的亚甲蓝和2体积的甲基红指示剂的混合物。
1.1.3主要设备
电热恒温干燥箱、电热恒温培养箱、多功能粉碎机、低速大量离心机、搁板秤、磁力搅拌器、精密酸度计、电子天平、数显恒温水浴锅、便携式压力蒸汽灭菌锅、电磁炉。
1.2实验方法
1.2.1流程图
(1)酸解液制备饮料的工艺流程。
蚕丝脱胶→酸解→阳离子交换树脂脱酸→丝素氨基酸。
中草药→清洗→浸提→粗滤→离心混合→
香精、VC、蔗糖等。
灌装→封口→杀菌→冷却→感官评定和卫生检验→成品。
(2)酶解液制备饮料的工艺流程。
蚕丝脱胶→氯化钙溶解丝素→酶解→灭酶→去除丝素中的氯化钙→氨基酸。
中药材→清洗→浸提→粗滤→离心→勾兑→灌装。
香精、VC、蔗糖等。
→封口→杀菌→冷却→感官评定和卫生检验→成品。
1.2.2蚕丝脱胶方法
将洗净晾干的蚕丝在0.4%、0.5%和0.6%的Na2CO3溶液中煮20min、30min和40min，确定最佳脱胶条件。
1.2.3丝素蛋白的酸水解方法
将脱胶后的丝素蛋白干燥，进行单因素实验。首先酸度3M，固液比为1∶50，111℃进行酸解15h，测定每小时氨基酸含量，从而得出酸解时间的适宜范围。然后选择1∶50的固液比，酸解时间在上述范围内。在110℃时，采用了1.0M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、5.0M等。最后，在合适的范围内选择酸浓度和时间，并通过选择不同的固液比1: 20、1: 30、1: 40、1: 50、1: 60、1: 70和65438。从酸浓度、固液比和酸解时间三个水平中选取合适的范围进行三因素三水平的正交试验，找出最佳酸解条件。
1.2.4丝素蛋白在氯化钙中的溶解
配制不同浓度(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%)的CaCl 2溶液，测定丝素蛋白在其中的溶解效果，找出溶解丝素蛋白的最佳CaCl 2浓度。
1.2.5酶解过程的研究方法(1)最佳水解酶的选择。在三种蛋白酶的最佳加酶量、酶解温度、酶解pH值和相同酶解时间下水解蚕丝蛋白溶液，比较三种酶的酶解效果，根据氨基酸得率选择水解效果最好的酶。(2)酶解条件的确定。根据上述实验确定的最适丝素蛋白酶，在底物浓度、pH值和温度三个水平上进行正交实验，确定酶解的最佳条件。底物浓度分别为4%、5%、6%，pH值分别为5.0、5.5、6.0，酶解温度分别为50℃、55℃、60℃。
1.2.6酸解液脱酸
采用732强酸性阳离子交换树脂对酸解液进行脱酸。当流出液使茚三酮反应成紫色时，停止上柱，用去离子水洗涤离子交换柱，直到流出液接近中性，然后用0.5M氨水洗脱氨基酸，直到茚三酮不再变成紫色。
1.2.7中草药汁的提取
将洗净的中草药和纯化水按65，438+0: 65，438+00的比例在90℃水浴中浸提65，438+0h，得到滤液，然后向残渣中加入8倍的纯化水，在90℃水浴中浸提0.5h，合并滤液和残渣，用低速大容量离心机离心，备用。
1.2.8饮料调配
设计3因素3水平1正交试验筛选饮料配方。为了对饮料进行分级，需要根据产品的色、香、味、组织状态确定一个分级标准。
1.2.9饮料的灭菌和卫生检验
饮料灭菌:将成品分别在90℃灭菌65438±05min、20min、25min，然后放入37℃恒温水浴培养箱中，观察其稳定性，选择最佳灭菌时间。细菌总数用平板菌落计数法测定。
1.3测试项目和方法
用微量凯氏定氮法测定蚕丝中的粗蛋白。甲醛电位法测定氨基氮含量。
1.3.1丝素蛋白水解液脱酸效果试验
用732型强酸性阳离子交换树脂，装入高40cm，φ 15的树脂柱中。当流出液使茚三酮呈紫色，说明树脂饱和，氨基酸溶液流出，此时停止上柱，用去离子水冲洗离子交换柱至流出液近中性，再用0.5M氨水洗脱氨基酸至茚三酮不反应显色，说明氨基酸已被除去。
1.3.2阴离子交换树脂去离子效果检测
选用溶解有CaCl2 _ 2溶液的丝素溶液通过柱高40cm、φ 15的阳离子交换树脂柱除去Ca2+，用NaOH溶液检测流出液中是否有Ca2+，当无白色沉淀时，通过柱高40cm、φ 15的阴离子交换树脂除去Cl-，用AgNO3 _ 3检测流出液中是否有Cl-，当无白色沉淀时，停柱。
2结果和讨论
2.1蚕丝脱胶条件的确定
蚕丝中的次生成分主要分布在丝胶蛋白中。为了保证丝素中氨基酸的质量，脱胶是必要的。丝素不溶于水，而丝胶溶于水。丝胶蛋白虽然具有亲水性，但在水介质中与丝素蛋白分离需要较长的时间，并且需要高温处理，所以采用Na2CO3作为分离介质。其中丝胶去除率(%) =丝胶溶液中的蛋白质含量(g)×100%丝胶总量(g)。测试结果见表1。
表1 Na2CO3正交试验设计方案及丝素去除结果
处理时间(分钟)浓度(%)丝胶去除率(%)
1 1(20) 1(0.4) 48.5
2 1 2(0.5) 35.7
3 1 3(0.6) 59.8
4 2(30) 1 60.3
5 2 2 100
6 2 3 100
7 3(40) 1 73.9
8 3 2 100
9 3 3 100
从表1可以看出，在0.5%的NaCO3溶液中煮30min脱胶效果最好。为了防止煮沸时水分蒸发，影响NaCO3的浓度，需要将容器盖好。蚕丝脱胶后为丝素蛋白，丝胶存在于水介质中。
2.2酸水解单因素实验
在3M H2SO4中用1g水解丝素蛋白，固液比为1∶60，110℃。发现丝素蛋白在H2SO4中可以完全溶解3小时。氨基酸水解在4 ~ 15h测得，氨基酸含量在8 ~ 10h较高，10h后变化不大，甚至开始下降。
在固液比为1∶60，110℃下酸解丝素8h，比较不同H2SO4浓度与氨基氮含量的关系。结果表明，酸解浓度过低或过高都会影响氨基酸含量，控制在3M~4M ~ 4 m为宜
丝素蛋白在3M H2SO4，110℃下酸解8h，测定了固液比对酸解的影响。丝素蛋白至少在1∶20的固液比下才能被浸泡，这是最小的固液比。结果固液比为1 ∶ 50 ~ 1 ∶ 70时水解效果最好。
2.3酸水解正交试验
从酸解的单因素实验可知，影响酸解的主要因素是酸浓度、固液比和时间，因此每个因素选取三个水平。实验结果如表2所示。
表2酸水解正交试验结果及分析
栏A B C
因素时间(h)酸转变(m)固液氨基酸产率(%)
实验1 1(8)1(3)1(1:50)69.1。
实验二2(9) 2(3.5) 2(1∶60) 73.2
实验三3(10)3(4)3(1∶70)71.9
实验四2 1 2 87.2
实验5 2 2 3 89.1
实验6 2 3 1 86.5
实验7 3 1 3 78.4
实验8 3 2 1 80.3
实验九三三二79.6
平均值为1 71 400 78.233 78.633。
平均值2 87.600 80.867 80.000
平均值3 79.433 79.333 79.800
范围16.200 2.634 1.367
表2中酸水解率最高的组合是A2B2C3，但表4中的理想组合是A2B2C2，所以与A2B2C2相比，结果显示丝素蛋白的氨基酸得率为89.8%，略好于A2B2C3，因此确定酸水解的最佳条件为:酸浓度3.5M，固液比1: 60，110℃。
2.4氯化钙溶解丝素蛋白的结果
丝素蛋白在CaCl2 _ 2溶液中的溶解度比较特殊，浓度低于35%或高于55%时几乎不溶，如表3所示，40%为最佳。
CaCl _ 2浓度与丝素溶解的关系
1 2 3 4 5 6 7 8
氯化钙浓度30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65%
丝素蛋白的溶解度为0 14.5% 100% 32.5% 15.5% 000。
2.5最适水解酶的确定
木瓜蛋白酶在pH 6.0，温度50℃，E/S=10%，丝素蛋白浓度为4%时水解。结果表明，酶解速度在前65438±0h内迅速增加，3h达到0.07mg/ml，之后缓慢增加。胰蛋白酶在pH8.0，温度40℃，E/S=2%，丝素浓度4%的条件下水解。在7小时内最大值为0.053毫克/毫升。中性蛋白酶在pH7.0、温度50℃、E/S=2%、丝素蛋白浓度4%时水解，3h达到0.065mg/ml。因此，木瓜蛋白酶的水解效果最好。
2.6木瓜蛋白酶水解丝素蛋白的正交试验
通过正交试验确定木瓜蛋白酶水解丝素蛋白的最佳条件组合。木瓜蛋白酶的最适酶解条件为:pH5.5，温度55℃，底物浓度5%，酶用量10%。最后，从1.001g丝素蛋白中可以得到0.1.001.1.84g氨基酸。从丝素蛋白酸解和酶解的比较中，得出酸解明显优于酶解的结论。
2.7饮料混合
饮料生产中应注意风味的调节。影响该饮料风味的主要因素是氨基酸浓度、中草药浓度和糖浓度，故设计了3因素3水平的1正交试验优化饮料配方。如表4所示。
表4饮料混合结果和分析
栏A B C
因子氨基酸中草药糖浓度实验结果(%)
浓度(%)浓度(%)
实验1 1(0.3)1(2)1(8)7.8
实验二1 2(3) 2(9) 7.4
实验三1 3(4) 3(10) 7.2
实验4 2(0.4) 1 2 9
实验五二二三八点五
实验6 2 3 1 8
实验7 3(0.5) 1 3 7.6
实验8 3 2 1 7
实验九三三二七点五
平均值为1 7.467 8.133 7.600。
平均值2 8.500 7.633 7.967
平均值3 7.367 7.567 7.767
范围1.133 0.566 0.367
从表4可以得出该饮料的最佳配方:氨基酸浓度为0.4%，中草药汁浓度为2%，糖浓度为9%，并添加少量桃香精和VC得到成品。
2.8饮料储存稳定性试验
本实验在装罐前后都进行了杀菌处理，并对中草药汁进行了离心处理，因此得到的饮料清澈透明。装罐后，通过不同杀菌时间观察稳定性。分别于90℃灭菌65438±05分钟、20分钟、25分钟，然后置于37℃恒温培养箱中观察。9天之后没有任何变化，依然是清澈透明的黄褐色溶液。
为了确定最佳灭菌时间，对保存9天的成品进行了细菌检测。结果，在90℃下灭菌25分钟，细菌总数为56个/ml，符合国家标准要求。
3产品质量标准
3.1感官指数
颜色:黄褐色，均匀。风味:酸甜，有丝蛋白氨基酸和中草药的微苦味，无异味。组织形态:汁液透明，无杂质，长期存放无沉淀。
3.2理化指标
酸度:pH 3.5 ~ 4.0，细菌总数≤100 /ml，大肠菌群≤3个/ml，不得检出致病菌。
4结论
酸水解丝素蛋白的氨基酸得率高于酶解，酸水解得率达到89.1%，而酶解得率仅为18.1%。酸水解比酶解简单，水解液的色泽和气味更好，所以酸水解用于制作饮料。最佳脱胶条件为0.5%碳酸钠煮沸30分钟。在此条件下，丝胶蛋白被完全去除，而丝心蛋白没有损失。将脱胶的丝心蛋白洗涤并干燥，然后进行酸水解。酸水解的最佳工艺条件为:3.5MH2SO4，固液比1∶60，10℃，时间9h，氨基酸得率高达89.8%。将阳离子交换树脂脱酸后的氨基酸溶液与中草药进行调配，得到最佳调配方案:丝素氨基酸浓度为0.4%，中草药浓度为2%，糖浓度为9%，VC浓度为0.2%。这样，一种清澈、酸甜的黄褐色饮料就制成了。