β-甘露聚糖的结构及其水解酶
10.5.2.1内切β-甘露聚糖酶
内切-β-甘露聚糖酶是水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖中β-1，4-糖苷键的酶。因为葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖除了甘露糖单元外，在聚合物的主链上还含有葡萄糖单元，还可能被特定的内切糖苷酶(内切-β-葡萄糖苷酶)水解，对具有甘露聚糖骨架的聚合物没有影响，所以不能称为甘露聚糖酶。
与木聚糖酶相比，对不同木霉种的甘露聚糖酶的研究要少得多，只有哈茨木霉E58和里氏木霉Rut C-30有过报道。一方面，两个物种都产生多种形式的甘露聚糖酶(Torrie等人，1990；斯塔尔布兰德等人，1993).木霉以纤维素或不同的甘露聚糖为碳源时能产生甘露聚糖酶。哈茨木霉对半乳甘露聚糖和纤维素产生的甘露聚糖酶活性几乎相同，但甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的比活性明显更高。另一方面，发现里氏木霉在纤维素存在下产生的甘露聚糖酶活性高于在半乳甘露聚糖存在下产生的甘露聚糖酶活性(Arisan-Atac等，1993)。然而，真菌不能在半乳甘露聚糖上很好地生长，并且在纤维素和半乳甘露聚糖上产生的每单位生物质的甘露聚糖酶的量是相似的。没有观察到甘露聚糖酶诱导的甘露糖或甘露糖的合成(Torrie等人，1990；Arisan-Atac等人，1993).
唯一被纯化和详细研究的木霉甘露聚糖酶来自里氏木霉Rut C-30(Arisan-Atac等，1993；斯塔尔布兰德等人，1993).在培养滤液中可以检测到至少五种具有甘露聚糖酶活性的酶形式。已经纯化和表征了等电点为4.6和5.4的两种主要酶形式。它们的分子量略有不同，分别为51kDa和53 kDa(stal brand等人，1995)。其他两种甘露聚糖酶的蛋白质性质非常相似。氨基酸比较和N端氨基酸序列好像也一样。Arisan-Atac等(1993)纯化的甘露聚糖酶，pI值为5.2，分子量为46kDa，可能与Stalbrand等(1993)分离的pI为5.2的酶相同。
来自里氏木霉的编码甘露聚糖酶的基因man1最近被分离并在酿酒酵母中表达。发现来自里氏木霉pI4.6和pI5.4的两种纯化形式的甘露聚糖酶以及其它形式的甘露聚糖酶可以由man1基因编码。与此相一致，里氏木霉基因组中man1基因的缺失将甘露聚糖酶活性降低至低于亲本菌株的10%。不同甘露聚糖酶形式的产生至少部分是由于翻译后修饰(如脱氨基作用)。
基于基因序列，发现里氏木霉甘露聚糖酶与几种纤维素酶具有相似的结构域:催化结构域和由连接肽分隔的CBD。这种酶也强烈结合纤维素，但没有检测到与甘露聚糖的特异性结合。然而，该酶不具有任何纤维素水解活性。基于疏水聚类分析，甘露聚糖酶(MAN I)属于糖基水解酶家族5。该家族包含来自变铅青链霉菌、Caldocellulosiruptor saccharolyticus和棘孢曲霉的几种纤维素酶和三种其它甘露聚糖酶(Suurnakki等人，1993；Suurnakki等人，1996).棘孢曲霉甘露聚糖酶与里氏木霉甘露聚糖酶具有较高的氨基酸序列同源性(70%)，但不含CBD。这两种细菌甘露聚糖酶似乎比真菌甘露聚糖酶彼此更接近，因此表明细菌和真菌的酶活性可能不同。在里氏木霉的甘露聚糖序列中也发现了两个谷氨酸残基(Primalco Biotec，芬兰，未发表的结果)。
10.5.2.2甘露聚糖水解中的辅助酶
(1)β-甘露糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。据报道，里氏木霉仅产生非常少量的胞内β-甘露糖苷酶，这可能是真菌在甘露聚糖上生长缓慢的原因(Arisan-Atac等人，1993)。之后再没有对木霉β-甘露糖苷酶的纯化或进一步研究。甚至真菌也可能不产生任何特定的β-甘露糖苷酶，用对硝基苯-D-吡喃糖苷作为底物测得的活性是由于类似于α-呋喃阿拉伯糖苷酶的β-木糖苷酶活性的其他外切葡聚糖酶的假活性。β-甘露糖苷酶也可能存在于真菌中，但大多数是胞内的。在这种情况下，随着纤维素酶的生物合成，类似于二葡糖苷酶的质膜结合转运系统可以将甘露聚糖片段转运到细胞中(Kubicek等，1993)。
已知里氏木霉产生至少两种β-葡萄糖苷酶(Barnett等人，1991；陈等，1992).目前尚未研究这些酶对葡甘露寡糖的水解活性，但水解实验中使用的来自其他生物的β-葡萄糖苷酶可以去除这些寡糖非还原端的吡喃葡萄糖残基(Takahashi et al .，1984)。目前尚不确定参与纤维素降解的β-葡萄糖苷酶是否参与半乳甘露聚糖的降解。
(2)α-半乳糖苷酶。在酵母中建立的里氏木霉表达文库的筛选证明里氏木霉至少产生三种α-半乳糖苷酶。三种酶(agl1、agl2和agl3)的基因已经被分离和表征。为了研究它们的催化活性，在酵母AGL III中产生了三种相应的酶(AGL I、AGLII和AGL III)(Margolles-Clark等，1996c)。
在三种酶中，AGL I对聚半乳甘露聚糖的活性最高。但AGL I的水解度相当低，甘露聚糖酶的存在明显提高了其活性，而β-甘露糖苷酶的加入影响不大。目前，酿酒酵母中产生的里氏木霉α-半乳糖苷酶已被纯化，也有两篇直接从真菌培养基中纯化里氏木霉α-半乳糖苷酶的报道(Zeilinger等，1993；Kachurin等人，1995).指出这些α-半乳糖苷酶的分子量和等电点非常相似，分别为50kDa和54kDa以及5.2和5.25，说明这些数据定义了同一种酶。根据分子量和水解特性，纯化的酶与AGL I相同(Zeilinger等，1993；Margolles-Clark等人，1996d).AGL I的对硝基苯-a-D-半乳糖苷活性可被半乳糖竞争性抑制。
另一种α-半乳糖苷酶AGL II对聚合底物几乎没有活性，但与甘露聚糖酶表现出协同作用，加入β-甘露糖苷酶后水解度进一步提高。当反应中加入甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶时，AGL ⅲ的活性也有所提高。然而，AGLⅲ的水解度远低于从AGLⅱ获得的水解度(Margolles-Clark等，1996e)。AGL ⅱ和AGL ⅲ与β-甘露糖苷酶有明显的协同作用，表明它们更倾向于选择寡糖非还原端甘露糖单元有半乳糖取代基的小寡糖作为底物。AGL对对硝基苯-a-D-吡喃半乳糖苷的活性低于蜜二糖(Gala1-6Glc)。这可以解释为什么在里氏木霉Rut C-30的培养滤液中没有发现对硝基苯-a-D-吡喃半乳糖苷，尽管基因agl3似乎被很好地表达(Margolles-Clark等人，1996e)。此外，agl2基因似乎得到了很好的表达，这可能解释了为什么AGLⅲ没有被首先分离出来。Zeilinger等人(1993)报道了在里氏木霉的培养滤液中存在少量的α-半乳糖苷酶AGL。
一方面，根据推导的AGLⅰ和AGLⅲ的氨基酸序列，它们属于糖基水解酶家族27，含有来自植物、动物、酵母和丝状真菌的α-半乳糖苷酶。另一方面，AGLⅱⅱ与细菌a-半乳糖苷酶家族36相似，因此它是第一个报道的与相应原核酶相似的真核a-半乳糖苷酶。Agl ⅲ在N-末端携带230个额外的氨基酸，这在家族27的其他酶中没有发现。这个额外的区域似乎对催化活性并不重要，因此它很可能是不同于迄今为止描述的任何多糖结合结构域的另一个功能结构域。最近，报道了里氏木霉AGL的活性位点含有催化重要的甲硫氨酸(Kachurin等，1995)。
(3)乙酰葡甘露聚糖酯酶。里氏木霉培养滤液中半乳甘露聚糖的去糖基化不如葡糖醛酸木聚糖酶有效，并且没有从任何木霉中分离出特异性的乙酰葡甘露聚糖酶(Tenkanen等，1993)。里氏木霉乙酰酯酶(AE)可以从木糖寡糖中释放乙酰基侧基，也可以作用于乙酰化的甘露糖寡糖。研究报告了来自石竹的乙酰木聚糖酯酶的类似特征(Biely等人，1996)。类似于乙酰木聚糖酯酶在葡糖醛酸中木聚糖的去糖基化中的行为，还发现AE与米曲霉的乙酰葡甘露聚糖酯酶在乙酰化半乳甘露聚糖的水解中协同作用，并且认为所观察到的协同作用至少部分是由于去除了位于半乳糖侧基附近的乙酰基，这可能容易接近乙酰葡甘露聚糖酯酶，但不容易接近乙酰葡甘露聚糖酯酶(Tenkanen，1995)。